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尿路感染病原体即时检测微流控系统研制

2024-09-04 44 上传者：管理员

摘要：为了实现现场快速诊断，研制了一种基于离心微流控技术的尿路感染病原体即时检测(POCT)系统。该系统由离心检测芯片、选通阀进样芯片和POCT装置组成。利用比色反应的原理，可在60 min内直接用肉眼观察到检测结果。实验定量结果表明，该系统对一定浓度范围内大肠杆菌富集效率为99.8%,检测限为10～5CFU/mL。最后，通过对大肠杆菌浓度梯度为10～5～10～8 CFU/mL的4组模拟样品进行检测，记录下4组浓度对应的检测结果。将结果制成标准比色卡，便于进一步对检测结果进行分析。该系统成本低、易操作、检测快，具有一定的应用价值。

关键词：
即时检测
尿路感染
感染性疾病
病原体富集
离心微流控
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尿路感染(urinary tract infection, UTI)是一种常见的感染性疾病，多由单一细菌侵入尿路所致。大肠杆菌是社区获得性尿路感染中分离出的最常见病原体，约占70 %～95 %。这种现象在怀孕期间更加普遍，如果没有进行及时的筛查与治疗，甚至会导致死亡[1]。

临床上对于UTI阳性的诊断标准为病人尿液细菌浓度大于1×105CFU/mL[2]。尿细菌培养作为尿路感染诊断的金标准，可以提供病原菌种类、数量及药物敏感性等关键信息。但通常需要2～3天的培养时间[3～5],检测周期长且需要专业的医疗设施，无法在一些偏远地区使用。另一种常见的尿路感染诊断方法是采用尿液试纸条，该方法操作简单，耗时短，但检测结果可靠性较低[6]。因此，开发成本低、易操作、结果可靠的即时检测(point of care testing, POCT)系统具有极大现实意义[7～9]。

微流控技术为病原体POCT提供了一种理想技术方案[10]。例如，Murdock R C等人设计了一种纸基微流控芯片，用于流感病毒的即时检测。能够快速确定患者是否患有感染性疾病以及对哪种类型的治疗做出反应。优点在于流感季节时能适应新的亚型而无需重新设计，但是在室温下反应时间较长[11]。Wang S等人开发了自动多通道可滑动离心圆盘，结合FTA卡和重组酶辅助扩增(recombinase aided amplification, RAA)技术检测鼠伤寒沙门氏菌。该系统检测灵敏度高，特异性强。但是RAA反应需要精确控制温度，微型加热器难以实现[5]。Hou X团队利用离心微流控圆盘集成镍纳米线和辣根过氧化物酶纳米花进行细菌富集及生物信号的放大，结合智能手机进行比色图像精确分析。该系统反应速度快、体积小，自动化程度高。但是通量较小，且生物传感器的制备存在组间及批次差异影响检测结果[12]。综上，POCT设备不仅要满足成本低、便携等要求，还应当在反应条件控制及通量等方面有所优化。

本文开发了一种尿路感染病原体POCT微流控系统，定位于偏远地区及初级医疗场所的尿路感染快速诊断。该系统包括离心检测芯片、选通阀进样芯片及POCT装置。在离心微流控芯片上2次离心分别将样本与检测液传送到细菌富集区，检测液与细菌发生比色反应，POCT装置提供反应所需驱动力及温度条件，在60 min内直接观察到检测结果。通过对大肠杆菌模拟样品进行富集和检测实验，计算出装置对于大肠杆菌的富集效率及最低检测限。此外，使用浓度梯度为105～108CFU/mL的4组大肠杆菌模拟样品制作出比色卡，便于后续进一步结果分析。

1、方法

1.1检测原理

本系统利用WST—8溶液与大肠杆菌的比色反应进行细菌可视化检测。WST—8是一种水溶性四唑盐，在电子介质存在的条件下与活菌细胞内的脱氢酶反应生成橙黄色甲臜产物[13](图1),橙黄色越深代表活菌数量越多。

图1基于WST—8的大肠杆菌比色检测原理

1.2芯片设计

1.2.1离心检测芯片设计

离心检测芯片采用圆形多层结构设计。为实现多组样本同时检测，该芯片上设置了3组样本检测通道，每组样本检测通道包括1个进样孔、1个储液室、1个过滤室和1个废液室(图2(a))。储液室、过滤室和废液室通过微通道连接。通过进样孔将样本加载到储液室，离心力驱动样本通过微通道进入过滤室，完成样本富集，过滤后的废液通过微通道进入废液室。再从进样孔加载检测液，通过低速离心将检测液转移到过滤室与富集的样本反应。

离心检测芯片结构使用SolidWorks2017软件设计，主要包括上层、粘合层、下层和基底层(图2(b))。上层为直径95 mm、厚度5 mm的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate, PMMA)圆板，其上环形等距设置3组储液室(1 mL),储液室上方为进样孔，底部边缘引出微通道(宽0.4 mm)与下层连接。下层是直径95 mm、厚度3 mm的PMMA圆板，其上环形等距设置3组过滤室与废液室，过滤室和废液室通过微通道连接，过滤室边缘设置有放置橡胶垫圈的凹槽。粘合层为直径95 mm、厚度0.1 mm的双面压敏膜(3M公司),用于粘合上层和下层。基底层为直径95 mm、厚度0.1 mm的单面压敏膜，用于芯片底部密封。每个过滤室的周围都设置有4个螺纹孔用于安装锁紧螺钉。废液室中填充吸水棉，以便快速收集废液。整个芯片直径95 mm,厚度9 mm。为了样本在离心力作用下能够均匀富集，储液室、过滤室和废液室间的微通道采用阶梯形结构设计(图2(c))。

芯片的上、下层使用计算机数控机床进行加工，粘合层和基底层使用激光切割机切割出图案。首先，在下层的过滤室位置依次安装垫圈和微孔滤膜(7184—004 Whatman,直径10 mm);然后，使用双面压敏膜粘合上层和下层，单面压敏膜密封芯片底部，热压机以0.45 kPa下加压30 min;最后，安装锁紧螺钉，完成芯片制作(图2(d))。

图2离心检测芯片设计

1.2.2选通阀进样芯片设计

为实现自动化的样本检测，设计了通阀进样芯片。选通阀进样芯片由阀盖、阀芯、密封垫片、芯片主体、垫圈、导管、快插接头(1个进气口、3个进样口)和EP管(3个样品管、3个试剂管)组成(图3(a)、(b))。芯片主体内部有多条用于液体转移的微通道，上表面凹槽用于安装阀芯。下表面多个接口分别用于安装导管、垫圈、EP管和快插接头。

阀芯内部设有U形通道，一端通过芯片主体内的微通道始终与进气口连接，另一端通过旋转阀芯分别与各样品管和试剂管连通，再通过芯片主体内的微通道，分别与3个进样口形成通路。当进行自动进样时(图3(c)),进气口接气源，进样口接导液管。控制阀芯旋转角度，选择需要连通的目标管，气体通过芯片主体和阀芯内的微通道进入目标管，目标管内液体在压强作用下转移到进样口，完成自动化进样。

图3选通阀进样芯片设计

1.2.3自动化检测控制流程

选通阀进样芯片有3组进样通道，对应离心检测芯片的3组检测通道。每组进样通道包括1个样品管、1个试剂管和1个进样口，3组进样通道共用1个进气口。

如图4所示，实验时该芯片的3个进样口分别与离心检测芯片的3个进样孔通过导管连接，进气口连接气源。旋转阀芯，进气口依次与样品管1→进样口1、样品管2→进样口2、样品管3→进样口3形成通路，在外接气源作用下依次将样品分别推入离心检测芯片的3个储液室。离心检测芯片高速离心后，样品由储液室经过过滤室最后到达废液室，完成样品富集。同样地，旋转阀芯让进气口依次与试剂管1→样品管1→进样口1、试剂管2→样品管2→进样口2、试剂管3→样品管3→进样口3形成通路，在外接气源作用下，3个试剂管内的检测试剂先被转移到样品管，再被推入离心检测芯片的3个储液室。低速离心使少量检测液停留在过滤室滤膜上，与富集的样品进行反应。通过观察过滤室内的颜色变化，实现对样品的检测。

图4选通阀进样芯片和离心检测芯片的自动化检测控制流程

1.3系统设计

为了实现自动化的进样和检测，搭建了一套POCT装置(图5(a))。包括自动进样单元和离心检测单元。自动进样单元以选通阀进样芯片为核心，蠕动泵作为外接气源、步进电机控制阀芯旋转，实现自动化进样。如图5(b)所示，步进电机通过联轴器连接转接件，与进样芯片的阀芯卡紧。控制步进电机旋转角度即可实现进样芯片的通道切换。蠕动泵通过导管与芯片的进气口连接，3个进样口通过导管分别经由3个进样针头与离心检测芯片的进样孔连接。步进电机和进样针头分别安装在滑台上，通过滑台导轨控制其上下移动。滑台侧面装有光电开关，对步进电机和进样针头进行限位。

离心检测单元通过直流电机为离心检测芯片提供流体驱动力，使用热电制冷器(thermoelectric cooler, TEC)辅以金属热沉片提供反应所需的温度条件。如图5(c)所示，离心检测芯片放置在用于温度传导的热沉片上，热沉片内部安装铂电阻温度传感器Pt1000,其底部与离心检测芯片的过滤室对应位置固定有3片用于温度控制的TEC。直流电机通过转接件固定于底板，离心检测芯片通过联轴器和锁紧螺母固定于电机转轴上，电机转动产生的离心力为离心检测芯片液体驱动力。整个装置体积为26 cm×17 cm×30 cm,重约6 kg。

图5机械结构设计

2、实验验证

2.1样品及检测液制备

大肠杆菌菌种购自通用生物(安徽)有限公司，用甘油封存于-80℃。5 mL的LB培养基中加入5μL卡那霉素和3μL大肠杆菌菌种，37℃200 r/min条件下培养过夜。将培养得到的大肠杆菌悬液在4 500 r/min条件下离心10 min后丢弃上清液，将细菌沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中。用PBS对细菌以10倍的浓度差进行连续稀释，以获得1.0×103～1.0×108CFU/mL的菌液备用。检测液采购商业化试剂盒(Microbial Viability Assay Kit-WST,Dojindo Molecular Technologies公司),该试剂盒包括WST—8与电子介质两种溶液，将上述两种溶液以9︰1的比例混合，再用蒸馏水将混合溶液稀释5倍完成检测液的制备。

2.2 POCT系统性能验证

离心检测芯片作为一种富集芯片，密封性和富集效率是其实现功能的必要条件。在验证了离心检测芯片的性能后，再在POCT装置上进行全流程实验，根据真实样本的检测结果制作出标准比色卡，作为后续检测时对细菌浓度进行半定量估测的依据。

2.2.1芯片密封性验证

在液体转移过程中离心检测芯片不出现渗漏是能够进行富集的前提，使用墨水代替样品在芯片上离心。首先在3个通道中各加入1 mL墨水，安装在图5(a)所示直流电机转轴上，使离心电机以5 500 r/min逆时针旋转15 s。然后取下芯片，观察到储液室中无液体残留、滤膜上出现墨水痕迹、芯片内部未出现渗漏(图6(a)),证明该芯片的密封性良好，液体按照设计的路径转移，且3个通道具有一致性。

2.2.2芯片富集效率验证

芯片对于一定浓度范围内样本的富集能力主要取决于滤膜上截留细菌的能力，由于滤膜上细菌难以准确计数，因此通过计算1 mL样本过滤前细菌数量与过滤后废液中细菌数量差值作为滤膜上富集到的细菌数量。富集效率公式如下

芯片为疏水材料，忽略液体残留。其中，C,C1分别为过滤前和过滤后1 mL样品中细菌的数量。

按照2.1节中步骤配制大肠杆菌浓度为1.34×103～1.34×108CFU/mL的6组样品。将样品加入到离心检测芯片上，5 500 r/min逆时针离心15 s。记录离心前后细菌数量并绘制富集效率图6(b)。根据拟合曲线得出该离心芯片在大肠杆菌浓度103～108CFU/mL范围内的富集效率为99.8 %。

2.2.3实际样本检测效果验证

POCT装置的功能是为离心检测芯片提供反应条件。若最终不同浓度的样本检测结果呈现明显区分度，则可以验证本系统作为大肠杆菌半定量估测工具的可行性。在POCT装置上进行全流程实验，步骤如下：配制大肠杆菌浓度为103～108CFU/mL的PBS溶液，在选通阀进样芯片的每个样品管中装入1 mL样本，按照样本进样→离心→检测液进样→离心→加热的步骤操作POCT装置。加热60 min后，滤膜上颜色稳定，不再加深。103CFU/mL和104CFU/mL两组样本无法直接肉眼观察到颜色变化，因此本文系统对于大肠杆菌可视化检测限为105CFU/mL。将反应结果记录下来(图6(c)),可见滤膜上呈现深浅不一的橙黄色，颜色强度与菌液浓度成正比，且相邻2个浓度梯度之间颜色差异明显。105CFU/mL浓度的样本所呈现出的进一步制作出标准比色卡图6(d),后续使用本文系统对未知浓度样品进行检测时，直接将可视化结果对照比色卡进行判断，可以得出样本的大肠杆菌浓度所在区间范围。能够更好地对尿路感染不同程度患者进行针对性治疗，减少广谱抗菌药物的使用，缓解耐药菌不断增长的严峻现状。

图6芯片的性能验证

3、结论

本文基于比色反应的检测原理，构建了一种基于离心检测芯片的尿路感染病原体POCT系统。首先介绍了离心检测芯片与切换阀进样芯片的设计原理，接着介绍了POCT装置的机械结构与电路原理。系统中离心检测芯片主体选用透明材料PMMA,将膜设置为面向顶层，实现检测结果的直接可视化。只需要手动将试剂装在切换阀进样芯片上，进样、离心、加热等步骤均在POCT装置上完成。最后在系统上用103～108CFU/mL的6组添加大肠杆菌的PBS溶液作为模拟样本，进行细菌的富集检测。实验结果表明该装置可在60 min内观察到结果，富集效率为99.8 %,检测限为105CFU/mL,且对105～108CFU/mL浓度范围内的大肠杆菌溶液具有很好的区分度。同时制作了标准比色卡便于后续实验结果分析。系统具有便携、易操作、检测时间快等优点，为尿路感染的即时诊断提供了一种实用的新方法。但该系统仍存在一定的局限性，虽然利用WST—8与大肠杆菌的比色反应可以反映出活菌的含量，但该方法不适用于特定病原体的检测。后续研究可以利用本系统的分离富集能力，进一步结合等温扩增等方法对病原体进行特异性识别。

参考文献:

[3]于培霞,高春艳,张晓慧,等.IQ200尿沉渣定量分析仪与H—800尿液干化学分析仪联合应用在尿路感染诊断中的价值[J].中国药物与临床,2016,16(1):131-133.

[4]马纪志,宁永忠.UF—100全自动尿液分析仪在尿路感染诊断和治疗方面的价值[J].中国误诊学杂志,2008,8(34):3.

基金资助:中国科学院青年创新促进会(2021442);

文章来源:张虹,张持健,潘井宇,等.尿路感染病原体即时检测微流控系统研制[J].传感器与微系统,2024,43(09):95-99.