甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus,HAV）、诺如病毒、星状病毒、戊肝病毒等食源性病毒经常引起人类肠道疾病的暴发和流行，严重威胁着人民群众的身体健康，进而影响国家的经济发展与社会稳定。其中，HAV为小核糖核酸病毒科嗜肝病毒属，包含1种血清型和6种基因型（基因型Ⅰ-Ⅵ），基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ感染人类并分别包括A、B两个亚型[1,2]。HAV通常以食物和水源作为载体，经粪-口途径进行传播，已成为贝类水产品、果蔬及其制品、各种水体中最常见的病毒病原体之一[3,4,5]。全球每年报告的HAV感染病例超过150万例，实际感染人数可能达到每年1亿～1.2亿人次[6,7,8,9]。

HAV因无法在体外进行细胞培养和传代，且感染剂量低，更是增加了其检测难度。近年来，伴随着生物技术的蓬勃发展，以核酸检测为主的分子生物学技术因具备特异性强、灵敏度高等优点，已成为HAV检测的有效手段，提升了HAV检测的准确性和效率[10]。本文对常见的HAV分子生物学检测方法优缺点及应用进行概述，以期为HAV的安全防控及海关食源性病毒的有效监管提供参考，助力我国提高应对突发公共事件及食品安全事件的应急能力。

1、基于核酸扩增法的HAV检测技术

1.1实时荧光定量PCR检测技术

实时荧光定量PCR(Real-Time Qualitative PCR,RT-qPCR）技术是在反应体系中加入特异性探针或非特异性染料，通过监测反应过程中的荧光信号积累而达到相对定量的方法。该技术因具备检测时限短、特异性强、灵敏度高等优势，目前已成为食源性HAV检测的“金标准”，应用范围十分广泛[11]。但该技术需借助专业的检测设备，会因实验条件污染、人员操作不当、基质效应等因素造成假阳性或假阴性结果。因此，在实际检测过程中实验室应加强对环境、试剂、设施、操作等方面的质量控制，在确保检测结果准确的前提下，不断提高HAV的检测灵敏度，更好应对感染低剂量HAV的突发事件。

Wang等[12]在国际标准ISO/TS 15216-2:2019Microbiology of the food chain+Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR—Part2:Method for detection的基础上，通过添加具有病毒聚合及沉淀功能的聚乙二醇（Polyethylene Glycol,PEG），改进了菲律宾蛤仔中HAV的富集方法，再采用实时荧光RT-qPCR方法进行HAV的检测，不仅回收率较国际标准ISO/TS 15216-2:2019显著提高，检测灵敏度也提高了10倍（改进的病毒富集方法中HAV减毒疫苗检测灵敏度为101.5 CCID50/mL），大大降低了假阴性检测结果发生的概率，确保人类食用贝类的安全。王娉等[13]建立了一种高灵敏度检测小浆果中低剂量HAV的方法，HAV减毒疫苗检测灵敏度可达4.49CCID50/mL，回收率达15.51%，在78批市售小浆果样品中HAV的阳性检出率为5.13%，较采用国际标准ISO/TS 15216-2:2019的检测方法检出率提高了4倍，具有很好的应用前景。Bennett等[14]采用实时荧光RT-qPCR方法，首次对爱尔兰地区零售的新鲜或冷冻即食浆果进行5种食源性病毒检测，研究结果发现6.7%(16/239）的样本中存在病毒核酸，其中2%的样本中存在HAV，研究证实了所有零售点销售的即食浆果均存在低剂量的病毒感染，病毒含量为0～16拷贝数/g。

1.2巢式PCR检测技术

巢式PCR(Nested PCR）技术是一种基于常规PCR方法的聚合酶链反应。在进行扩增反应时需设计2套特异性引物，即外套引物和内套引物。外套引物与常规PCR引物对相似，进行第1轮扩增反应。再将第1轮PCR产物作为反应模板并加入内套引物以完成第2轮扩增反应，通过2轮扩增反应大大提高了扩增反应的特异性和敏感性。Fantilli等[15]和Castro等[16]均采集了阿根廷不同年份的污水，对样本中的HAV进行检测分析，经巢式PCR反应后进行样本的遗传鉴定和系统进化分析，发现分离株均为南美洲最流行的ⅠA基因型，研究结果为污水和处理后水的病毒检测及防控提供依据。同时有相关专题报道了巢式PCR的显著优势，该技术几乎可对所有肠道病毒的VP1基因区域进行扩增，更适用于HAV亚基因型的分型研究[17]。

巢式PCR技术因反应模板和引物的改变，大大降低了PCR反应中非特异性扩增的可能性，从而保证PCR反应的高度特异性和准确性。但因该技术需要进行第2轮扩增反应，引起交叉污染的几率较大且不适用于快速检测。

1.3数字PCR检测技术

数字PCR(Digital PCR,dPCR）技术是将单分子核酸模板分别置于微小的反应区域中，经PCR扩增反应后计算阴阳性反应的比例，以实现核酸的定量检测。目前，基于不同的分液方式，dPCR主要分为微滴数字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR）、微流体数字PCR(Microfluidic Digital PCR,mdPCR）和芯片数字PCR(Chip Digital PCR,cdPCR)[18]。相关报道建立的食品及饮用水中HAV和诺如病毒（Norovirus,NoV）三重ddPCR检测方法，HAV检测限可低至5.0拷贝/反应[19]。贝类样品采用ddPCR技术检测HAV的检测灵敏度可达12.54CCID50/2 g[20]。Larocque等[21]采用cdPCR方法对冷冻浆果中HAV进行定量研究，结果表明此方法检测低剂量的HAV可得到更精准的定量结果。由此可见，在HAV检测中，特别是低剂量病毒检测时，d PCR在实现绝对定量的同时，可以提供精准度更高的检测结果。但该技术也存在一些缺点，例如设备相对昂贵、检测成本较高及对检测人员专业知识要求高。面对食源性病毒绝对定量检测技术标准化缺失的现状，d PCR技术将具备巨大潜力和应用前景。

1.4环介导等温扩增检测技术

环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）方法因不依赖特殊设备，在恒温状态下即可完成循环反应，更适合于现场的快速检测。Wu等[22]将逆转录环介导的等温扩增（Reverse Transcription Loop-mediated isothermal Amplification,RT-LAMP）技术与实时生物发光检测（Bioluminescent Assay in Real-Time,BART）技术相结合，建立RT-LAMP-BART两步法对草莓、贻贝、牛奶和青葱等食品基质中HAV开展检测，检出限分别达8.3×100 PFU/50 g、8.3×100 PFU/5 g、8.3×100 PFU/40 mL和8.3×100 PFU/15 g，显著提高了基于LAMP技术检测HAV的灵敏度。崔健等[23]及谢进维等[24]均依据有代表性的HAV基因信息设计LAMP引物，构建可视化RT-LAMP方法用于检测食源性HAV，检测灵敏度分别为10.76 copies/μL、10 copies/μL。

LAMP技术试验操作简单、成本低、灵敏便捷，30～60 min即可完成扩增反应获得试验结果。但LAMP技术需对靶基因的6～8个区域设计4～6种引物，相对其他检测技术而言引物设计较为复杂，易出现假阳性检测结果，同时该技术无法进行高通量检测。目前，有研究报道将LAMP技术与微流控芯片（Microfluidic chip）技术相结合的环介导等温扩增微流控芯片检测技术应用在传染病病毒的检测中，表现出很好的特异性[25]。该结合检测系统不仅能够提高检测效率、简化检测流程，还可以降低气溶胶等反应污染的风险，已发展为分子检测领域的研究热点[26,27]。

1.5重组酶聚合酶扩增检测技术

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）检测技术是目前全球最新的一种等温扩增技术[28]。该技术在37～42℃的条件下依赖结合单链核酸的重组酶、DNA聚合酶和单链结合蛋白等即可完成目标片段的扩增反应，并可在20 min内得到检测结果。因操作简单、反应迅速、设备要求低而适合于现场检测。孙栋良等[29]基于荧光RPA技术建立了水和食品中HAV的快速检测方法，4 min即可检测到特异性扩增目的片段，检测灵敏度可达15.6 copies/μL。RPA被较多研究者看作是可以替代PCR扩增反应的技术，但该技术也存在一定的局限性，例如无专用软件进行引物设计，研究人员只能从大量合成的引物对中筛选出最佳的引物序列用于后续研究，由此造成该技术无法对较短的核酸序列进行扩增反应。随着今后此技术的进一步临床验证和推广应用，笔者认为该技术有望成为分子检测领域的主流技术之一。

2、CRISPR基因编辑检测技术

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR）系统是采用基因敲除、基因插入、碱基替换等方法完成基因组编辑和基因治疗的一种新技术，具有高效、精准、快捷等优势，是实现微生物组工程化的重要工具，在生物学领域的应用潜力备受学者关注[30,31,32]。杜玉婉[33]将新型表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS）基底材料与CRISPR/Cas体系相结合，采用拉曼光谱分析HAV的载量，建立SERS-Cas14a体系检测HAV的新技术，可在1 h内完成病毒核苷酸序列的检测，检测限可低至0.1 fmol/L，实现了HAV的高灵敏度检测。目前，CRISPR检测技术尚处于实验阶段，在试验中存在脱靶率高、引导RNA设计困难、相关蛋白类型选择难等问题。但随着CRISPR基因编辑检测技术的不断深入发展，必将在分子生物学领域发挥巨大的作用并产生深远的影响。

3、二代基因测序检测技术

二代基因测序（Next-Generation Sequencing,NGS）检测技术可在短时间内对数百万条核酸同时进行并行测序分析，包括合成测序和杂交测序两种方法，具有高通量、高效率等优势，被广泛应用在病毒基因组学、病毒转录组学、分子流行病学等生物学领域，并且该技术在基因分型分析和混合病毒检测中具有明显的优势[34,35]。黄腾达[36]利用二代测序技术在12份甲肝急性期患者血清标本中获得HAV流行株VP1-2A区的准种序列，分析发现各标本中频数最高的优势准种序列占全部准种序列的近50%，获得的HAV准种序列图谱为流行病学溯源调查提供了更为全面的序列信息。但NGS技术也存在一些缺点，包括读取序列的长度较短，检测成本高，容易因环境、试剂等因素影响试验结果的分析。

4、基因芯片检测技术

基因芯片（Gene chip）检测技术是将大量的核酸分子以分子点阵的形式排布在很小的载体上，应用碱基互补杂交原理采集信号以实现样本中目的基因的检测和分析。万志香[37]建立了应用DNA-纳米金探针的目视化HAV检测基因芯片技术，在银染12 min的情况下可检测到浓度为100 fM的HAV目的核酸片段。与传统的基因检测技术相比，基因芯片技术能够实现分子水平高通量、高精度、微型化、自动化的检测，已在食品中病原微生物、生物医学等研究中取得了一定的进展[38,39]。但该技术也存在一些缺点，例如检测成本较高、操作人员技术能力要求高、探针合成时易因掺入杂质而降低特异性、无标准化规范等，此类因素的存在限制了该技术在病毒检测中的应用。

5、结语

HAV感染引起的腹泻性疾病具有发病率高、传播快、影响广等特点，已成为全球重要的公共卫生问题之一。近年来，海关系统多次发布食品中检出食源性病毒的通报及风险预警。为保障海关监管职能的有效性，一方面，检测技术机构必须借助检测技术的革新、完善和融合，不断提高食源性介质中HAV检测的准确性；另一方面，海关监管部门应注重源头管理，加强对食品加工、养殖、运输等环节中易造成病毒污染的环境或介质的监控力度。通过技术和监管的结合，建立系统化、有针对性的检测体系及安全检测预警平台，以降低各个环节感染病毒的风险，提高口岸突发公共卫生事件应急防控能力并降低公共卫生事件发生的概率。

本文概述的常见分子检测技术在HAV检测中均有广阔的应用前景，各个检测技术在实际检测中也具有各自的优缺点和适用范围。随着分子生物学技术的发展，国内外研究学者均积极探索简便、快捷、准确的HAV检测方法。已有研究学者将多重PCR与NGS技术相结合建立了HAV 4个基因型的鉴定方法；采用等温快速扩增结合侧流式试纸在无需分子实验室的情况下便可简便快速的检测HAV[40,41]。同时，随着纳米技术的不断发展，研究人员以纳米材料为标记物与分子检测技术相结合，实现HAV的现场灵敏便捷检测[37]。可见不同技术的融合应用，不仅能提高检测效率和结果准确性，还为未来HAV的检测提供了一个新的研究方向和平台。

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基金资助:辽宁省科学技术计划项目(2022JH2/101300041);大连海关科研项目(2022DK04,2022DK08);

文章来源:齐欣,王殿夫,徐文英,等.分子生物学技术在甲型肝炎病毒检测中的研究进展[J].中国口岸科学技术,2024,6(03):43-48.