首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 脑卒中论文 > 疏血通注射液激活PI3K/Akt通路改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能

疏血通注射液激活PI3K/Akt通路改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能

2025-03-31 102 上传者：管理员

摘要：目的探讨疏血通注射液对缺血性脑卒中大鼠神经功能恢复的影响，并探索其作用机制。方法采用大脑中动脉闭塞（MCAO）法建立大鼠缺血性脑卒中模型，将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及疏血通注射液低、高剂量（1、2 mL/kg）组，每组10只。在缺血性脑卒中后3 h及3、7、14 d评估神经功能评分，并测量脑梗死体积；利用苏木素–伊红（HE）染色观察海马缺血区域病理形态学变化；采用免疫荧光染色检测BrdU+/Nestin+和BrdU+/DCX+阳性细胞数量，Western blotting分析突触后致密区95（PSD-95）和突触小泡蛋白（SYP）蛋白相对表达水平。构建体外氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型，采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测0～80μmol/mL疏血通注射液对PC12细胞的增殖情况，并采用Western blotting疏血通注射液对磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路的影响。结果与模型组相比，在第3、7、14天，疏血通注射液低、高剂量组神经功能缺损评分降低（P<0.01）。缺血后14 d，疏血通注射液低、高剂量组脑梗死体积降低，BrdU+/Nestin+和BrdU+/DCX+阳性细胞数量增加，SYP和PSD-95蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组相比，10μmol/mL疏血通注射液组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白水平显著升高（P<0.01），而这些作用可被Akt抑制剂MK-2206和PI3K抑制剂BKM120减弱。结论疏血通注射液可通过激活PI3K/Akt通路改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能。

关键词：
疏血通注射液
磷脂酰肌醇3激酶
神经功能
突触后致密区95
突触小泡蛋白
缺血性脑卒中
蛋白激酶B
加入收藏

脑卒中是一种严重威胁人类健康的疾病，其中缺血性脑卒中占比较高，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，给社会和家庭带来了沉重的负担[1]。尽管目前在缺血性脑卒中的治疗方面取得了一定进展，但仍然存在治疗时间窗有限以及部分患者治疗后神经功能恢复不佳等问题[2]。因此，寻找有效的治疗方法和药物来改善缺血性脑卒中患者的神经功能恢复具有重要的临床意义。近年来，随着对中枢神经系统可塑性研究的深入，人们认识到内源性神经发生在脑损伤后的修复过程中起着至关重要的作用[3]。神经干细胞（NSCs）能够在脑缺血损伤后被激活，通过增殖、迁移和分化为成熟的神经元，参与神经功能的修复[4]。同时，多种信号通路也参与了这一复杂的过程，其中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路在调节细胞存活、增殖、分化及血管生成等方面具有关键作用，其激活对于改善脑缺血后的神经功能具有重要意义。中药注射液在我国脑卒中的治疗中应用广泛，疏血通注射液是一种中药制剂，主要由水蛭、地龙提取物组成，具有活血化瘀、通经活络的功效[5]。临床研究表明，疏血通注射液在缺血性脑卒中的治疗中具有一定的疗效，能够改善患者的神经功能缺损症状[6]。本研究旨在探讨疏血通注射液对缺血性脑卒中大鼠神经功能的影响，并进一步研究其是否通过增强神经发生和激活PI3K/Akt信号通路来发挥作用，为其临床应用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1细胞与动物

高度分化的PC12细胞购自中国上海细胞库。40只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量为280～320 g，购自上海实验动物研究中心，动物使用许可证号SCXK(沪)2020-0005，动物实验经郑州大学第一附属医院科研和临床试验伦理委员会批准（批件号2024-D0408）。动物饲养在温度约为5℃、相对湿度约为60%的恒定环境中，食物和水不受限制。

1.2实验试剂

疏血通注射液（规格2 mL/支，批号202305156）购自牡丹江友搏药业有限责任公司；多聚甲醛（批号158127）、5-溴-20-脱氧尿苷（BrdU，批号B8434）均购自美国Sigma-Aldrich公司；2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC，批号T491113）购自阿拉丁；Nestin一抗（批号BY-0006R）购自上海博耀生物科技有限公司；脑源性神经营养因子（批号500-P84BT）购自上海研卉生物科技有限公司；PI3K（批号ab154598）、磷酸化PI3K（p-PI3K，批号ab302958）、Akt（批号ab8805）、磷酸化Akt（p-Akt，批号ab279732）、PSD-95（批号ab192757）、SYP（批号ab32127）和二抗（批号ab256816）均购自英国Abcam公司；MK-2206（批号WGC308046）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；BKM120（批号HY70063）购自Med Chem Express生物科技有限公司。

1.3实验仪器

bsa124s电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HWS-26恒温水浴锅购自上海一恒科学仪器有限公司；Allegra C-34R离心机购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；LEICA-CM1950组织切片机购自徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；SteREOLumar V12荧光显微镜购自卡尔蔡司（上海）管理有限公司；HT7700透射电子显微镜购自日立高新技术公司；BioLogic DuoFlow 40蛋白质印迹设备购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；XR-XB120旷场实验设备购自上海欣软信息科技有限公司。

1.4大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的建立和治疗

通过MCAO建立缺血性脑卒中模型，大鼠ip2%戊巴比妥钠40 mg/kg进行麻醉，仔细分离颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和左颈总动脉（CCA）。用手术缝线结扎颈外动脉和左颈总动脉，并用微动脉夹夹闭颈内动脉。在左颈总动脉上切开一个小腔后，将一根尼龙线轻轻插入颈内动脉，60 min后进行再灌注[7]。将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及疏血通注射液低、高剂量（1、2 mL/kg）组，每组10只。假手术除不进行缺血再灌注操作外，其他操作与各组相同。造模后，假手术组和模型组均尾iv 2 mL/kg生理盐水；疏血通注射液低剂量组尾静脉注射疏血通注射液1 mL/kg，高剂量组尾iv疏血通注射液2 mL/kg[8]，并根据体质量连续每天给药1次，共14 d。

1.5神经功能缺损评估

在缺血性脑卒中后3 h及3、7、14 d评估神经功能评分。评分标准如下：0分，无神经功能缺损症状；1分，对侧前爪不能完全伸展；2分，对侧抵抗力下降；3分，单向旋转；4分，不能自主行走，意识下降。分数越高表示神经功能损伤越严重[9]。

1.6脑梗死体积测量

大鼠麻醉后断头处死，迅速分离脑组织并在−20℃冰箱中冷冻约20 min。去除小脑、脑干和嗅球前部，将脑组织切成5个2 mm厚的冠状切片。将切片立即在2%的TTC溶液中孵育20 min。按照冠状切片的顺序放置脑切片并拍照。使用Image J测量脑梗死体积。梗死体积比＝梗死体积/总脑切片体积

1.7苏木精–伊红（HE）染色

灌注后，迅速分离脑样本并固定在4%多聚甲醛中。使用自动脱水机脱水后，将组织包埋在石蜡中并切成6 μm切片，并用HE染色。用光学显微镜（×200）拍摄海马齿状回的图像。

1.8免疫荧光染色

为了评估神经细胞增殖，从第9～13天，每组大鼠每天ip 2次BrdU，剂量为50 mg/kg，进行双重免疫荧光染色。用1% Triton破坏细胞膜，并用10%山羊血清封闭。然后，将切片在4℃下与大鼠单克隆抗体（1∶500）孵育24 h。所用抗体为BrdU、Nestin和双皮质素（DCX）。用PBS洗涤后，加入二抗。覆盖切片并使用荧光显微镜拍照。

1.9氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型制备

正常PC12细胞在RPMI 1640培养基中培养，并含有10%胎牛血清，在常氧条件下（37℃、95%O2和5% CO2）培养。在无葡萄糖或缺氧（94% N2和5% CO2）的RPMI 1640培养基中培养高度分化的PC12细胞8 h，然后复氧12 h，制备OGD/R细胞模型。在疏血通注射液处理前，分别将细胞与TrkB和PI3K抑制剂（ANA-12和LY294002）在10μmol/L下孵育30 min。高度分化的PC12细胞在OGD/R处理后，有或无疏血通注射液处理12 h[10]。

1.10细胞增殖实验

将高度分化的PC12细胞接种在96孔板中过夜。本研究采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）观察不同浓度（0～80μL/mL）疏血通注射液对细胞增殖的影响，并选择最佳浓度。采用上述方法构建OGD/R模型。在加入ANA-12和LY294002后，观察疏血通注射液处理对细胞增殖的影响。

1.11 Western blotting实验

使用BCA试剂盒检测海马组织和高度分化的PC12细胞中的蛋白质水平。通过电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜上，然后将其置于用1×TBST配制的5%脱脂奶粉中完全浸泡进行封闭。分别加入兔抗小鼠单克隆抗体PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、PSD-95、SYP一抗（1∶1 000），加入二抗后，使用化学发光凝胶成像系统分析蛋白质信号。

1.12统计学分析

采用IBM-SPSS-Statistics 24.0统计软件开展数据统计分析。定量资料以x±s描述，利用ANOVA单因素方差分析对组间进行比较，采用SNK法进行事后的两两比较。

2、结果

2.1疏血通注射液对缺血性脑卒中后的神经功能及梗死体积影响

如表1所示，在缺血性脑卒中后3 h及3、7、14 d，与假手术组相比，模型组神经功能缺损评分显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，在第3、7、14天，疏血通注射液低、高剂量组神经功能缺损评分显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，缺血后14d，疏血通注射液低、高剂量组脑梗死体积显著降低（P＜0.01）。结果表明，疏血通注射液以剂量相关的方式改善了缺血性脑卒中后的神经功能。

2.2疏血通注射液对缺血性脑卒中大鼠的脑部病理变化影响

如图1所示，假手术组病理学正常，未观察到神经元坏死。模型组神经元排列紊乱，细胞膜受损，形态肿胀。此外，许多神经元丢失和死亡，一些细胞核溶解和浓缩。然而，疏血通注射液低、高剂量组的细胞膜和细胞结构破坏、神经细胞坏死和核浓缩均得到明显改善。

2.3疏血通注射液对缺血性脑卒中大鼠神经发生的影响

如图2所示，假手术组在齿状回缺血区域很少检测到BrdU+/Nestin+和BrdU+/DCX+阳性细胞。然而，模型组大鼠中这些细胞均增加（P＜0.01），表明NSCs的增殖和迁移被缺血激活。此外，在疏血通注射液低、高剂量组，BrdU+/Nestin+和BrdU+/DCX+阳性细胞数量均显著增加（P＜0.01），表明疏血通注射液促进了脑缺血后NSCs的增殖和迁移。表1各组大鼠神经功能评分（A）和相对梗死体积（B）比较如图3所示，与假手术组比较，模型组PSD-95和SYP蛋白相对表达水平明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，疏血通注射液低、高剂量组SYP和PSD-95蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。表明在疏血通注射液治疗期间，来自NSCs的新神经元可以与宿主神经元形成突触连接。

2.4疏血通注射液对海马组织PI3K/Akt信号通路的干预

如图4所示，与假手术组比，模型组p-PI3K/ PI3K和p-Akt/Akt显著下降（P＜0.01）；与模型组相比，疏血通注射液低、高剂量组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白显著升高（P＜0.01）。表明PI3K/Akt通路可能参与疏血通注射液对脑缺血再灌注损伤的保护机制。

2.5疏血通注射液对PC12细胞PI3K/Akt的干预

在正常条件下，0～80μL/mL疏血通注射液处理PC12细胞后，细胞增殖差异无统计学意义。在OGD/R条件下，2.5～40μL/mL疏血通注射液处理显著增加细胞增殖，最佳剂量为10μL/mL。在处理前加入Akt抑制剂MK-2206和PI3K抑制剂BKM120均降低了细胞增殖，见图5。

图1各组海马缺血区域HE染色

图2各组BrdU+/Nestin+和BrdU+/DCX+阳性细胞的荧光染色（×200）和定量分析

图3各组大鼠PSD-95和SYP蛋白相对表达水平比较

图4疏血通注射液激活PI3K/Akt信号通路

图5疏血通注射液对PC12细胞的增殖作用

如图6所示，疏血通注射液增加了p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白质水平，这些增加被MK-2206和BKM120减弱。表明疏血通注射液促进脑缺血大鼠的神经功能恢复，并且可能与PI3K/Akt信号的激活有关。

图6疏血通注射液在体外通过激活PI3K/Akt信号促进神经增殖

3、讨论

中药注射液由于具有多靶点、起效快和协同作用，在急诊治疗中具有独特优势，使其成为化学药的合适补充[11]。同时，中药注射液也有一些局限性。近年来，有报道称一些特定的中药注射液与严重不良事件如感染、过敏反应，甚至死亡有关[12]。然而，需要注意的是，并非所有的中药注射液都与严重不良反应有关，许多在临床实践中已被安全有效地使用。疏血通注射液是一种广泛用于治疗缺血性心脑血管疾病的中药注射液，并显示出多成分和多靶点的特征。国家卫生健康委员会发布的《中国缺血性中风中成药合理使用指导规范》中，疏血通注射液被列为治疗缺血性脑卒中的常用中成药之一[13]。

本研究重点关注脑卒中恢复期的神经功能康复和神经再生。本研究在缺血后14 d的观察期内研究疏血通注射液对行为和认知功能康复的影响。行为实验表明，疏血通注射液显著改善了缺血性脑卒中大鼠的空间认知缺陷并增强了其活动能力。此外，在本研究中，疏血通注射液治疗有效地改善了缺血半暗带的病理和神经元超微结构变化。这些结果表明，疏血通注射液治疗在神经功能的长期恢复中起着重要作用。

PI3K/Akt信号通路在缺血性脑卒中可以抑制细胞凋亡，从而促进神经元的存活。能够促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，增加缺血组织的血液灌注，改善微循环。还可以调节炎症因子的表达，减少炎症细胞的浸润，从而减轻缺血性脑卒中后的炎症反应[14]。本研究发现疏血通注射液显著增加了p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白质表达，增强了缺血区域的神经发生水平。此外，PI3K和Akt抑制剂显著抑制了疏血通注射液对体外神经增殖的影响。本研究结果表明，疏血通注射液治疗激活的PI3K/Akt信号可能有助于MCAO大鼠的神经发生，这在缺血性脑卒中治疗中起着至关重要的作用。

综上所述，疏血通注射液通过激活PI3K/Akt信号通路促进神经功能和神经发生。因此，疏血通注射液可能是一种通过促进内源性神经发生治疗缺血性脑卒中的有效药物。本研究为中医药治疗缺血性脑卒中提供新的理论依据和治疗策略，有望改善患者预后并拓展临床治疗思路。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

[1]黄奇,刘志华,程率芳,等.中药单体靶向缺血性脑卒中相关通路的药理作用机制研究进展[J].药物评价研究, 2024, 47(6): 1413-1420.

[2]焦丹阳,刘昊天,王金麒,等.缺血性脑卒中治疗相关国内外研究热点与前沿分析[J].中华老年心脑血管病杂志, 2024, 26(9): 1110-1112.

[3]陈彦熹,徐志栋,孙芳玲,等.缺血性脑卒中后神经发生相关信号通路及药物研究进展[J].中国医药导报,2023, 20(21): 35-39.

[4]曾宗伟,欧阳荣键,吴昊,等.神经干细胞治疗缺血性脑卒中的研究进展[J].现代临床医学, 2024, 50(3): 238-240.

[5]理扎·沙布尔江,尚津锋,文胤琏,等.疏血通注射液通过抑制泛凋亡改善大鼠脑缺血再灌注损伤[J].中草药, 2024, 55(18): 6238-6249.

基金资助:河南省科技攻关计划项目(242102311261);河南省高等学校重点科研项目计划(23A360018);

文章来源:刘桠菲,周霖,郑天元,等.疏血通注射液激活PI3K/Akt通路改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能[J].现代药物与临床,2025,40(03):557-563.