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DDX60促进系统性红斑狼疮患者PBMCs中Ⅰ型干扰素的表达

2024-07-02 46 上传者：管理员

摘要：目的探究DExD/H盒解旋酶60(DDX60)通过调控dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ通路对系统性红斑狼疮(SLE)进展的作用机制。方法通过分析RNA测序数据集发现DDX60 mRNA水平在SLE患者和健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中的差异。分析SLE患者PBMCs的DDX60 mRNA水平与疾病活动度的相关关系。通过α干扰素(IFN-α)刺激人源单核细胞系THP-1,明确DDX60是否为干扰素诱导基因(ISG)。通过沉默和敲除DDX60,再转染双链DNA(dsDNA)poly(dA:dT),利用RT-qPCR检测β1干扰素(IFNB1)的mRNA水平。结果 RNA测序数据集和RT-qPCR结果表明DDX60在SLE患者PBMCs中高表达。相关性分析表明，SLE患者PBMCs的DDX60 mRNA水平与疾病活动度呈正相关关系。IFN-α可以诱导THP-1细胞表达DDX60,表明DDX60是ISG。沉默DDX60后，poly(dA:dT)诱导的IFNB1 mRNA水平显著降低。结论 DDX60在SLE患者PBMCs中高表达，IFN-Ⅰ-DDX60-dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ正反馈通路参与SLE进展，可能成为SLE临床诊治的靶点，具有诊断及预后评估价值。

关键词：
cGAS
DDX60
DExD/H盒解旋酶60
Ⅰ型干扰素
环鸟苷酸-腺苷酸合成酶
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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的系统性自身免疫病，患者血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体，全身多脏器结缔组织受累，可引起肺部病变，严重损害患者的生活质量[1,2]。血清中Ⅰ型干扰素(type Ⅰ inter-feron, IFN-Ⅰ)水平升高是SLE的主要病理特征之一，其水平与患者疾病活动度呈正相关[3]。IFN-Ⅰ(包括α干扰素和β干扰素)作为一种重要的免疫调节因子，可以经JAK-STAT通路诱导下游大量干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene, ISG)表达，包括环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)和DExD/H盒解旋酶58(DExD/H box helicase 58, DDX58)等模式识别受体以及干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)1/7等通路分子[4]。SLE患者血清高水平的IFN-Ⅰ可作为危险信号，促进组织浸润免疫细胞的免疫反应及IFN-Ⅰ产生，形成时空闭环，导致疾病进展。虽然患者外周血循环免疫细胞表现出典型的“Ⅰ型干扰素特征”(IFN-Ⅰ signature),但几乎不表达IFN-Ⅰ,推测IFN-Ⅰ可能来源于外周组织浸润的免疫细胞[5]。

SLE患者外周组织发现大量免疫细胞，特别是中性粒细胞的浸润、活化与死亡，细胞死亡释放的双链DNA(dsDNA)被免疫细胞胞质中的cGAS识别，介导IFN-Ⅰ产生，促进SLE进展[6]。作为一种胞质dsDNA受体cGAS,在天然免疫细胞识别“自我”与“非我”的过程中发挥重要作用，其介导的cGAS-STING通路近年来受到广泛关注。已有大量研究表明cGAS-STING通路在SLE中具有关键致病作用，研究该通路的调控分子机制对于理解SLE的发病机制以及临床干预策略具有重要意义。

DExD/H盒解旋酶(DExD/H-box RNA helicases)是一个庞大的蛋白质家族，解旋酶结构域是该家族的核心结构域，其包含一段保守的DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)基序，是DExD/H盒解旋酶发挥功能的关键基序[7]。除了作为RNA解旋酶发挥RNA加工以及基因表达与调控等经典功能外，非经典功能如调控免疫应答，也受到了广泛关注，如经典的双链RNA(dsRNA)受体DDX58以及各种通路调控分子如DDX41[7,8,9,10]。DDX60作为该家族的一员在SLE患者中显著高表达，但其分子机制及在SLE发病中的意义并不十分清楚。本研究通过生物信息学分析以及利用THP-1细胞进行细胞水平实验，证实IFN-Ⅰ可以诱导DDX60表达，高表达的DDX60促进dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ通路，由此形成通路正反馈，且DDX60表达水平与SLE患者疾病活动度(SLE disease activity index, SLEDAI)呈正相关。该研究拓展了对SLE发病的分子机制认识，对临床的治疗方案可能具有指导意义。

1、材料与方法

1.1 材料

IFN-α及佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)(MedChemExpress公司);SiRNA(Ribobio公司):Si-NC、si-DDX60;Poly(dA:dT)(Invivogen公司);转染试剂RNAiMAX及BCA蛋白质检测试剂盒(Thermo Fisher公司);转染试剂JetPrime(Polyplus公司);总RNA抽提试剂盒(Fastagen公司);反转录试剂盒及SYBR green qPCR试剂盒(Toyobo公司);抗GAPDH抗体、抗DDX60抗体(Sigma-Altrich公司);细胞系：人单核巨噬细胞系THP-1(国家实验细胞资源共享平台)。

1.2 方法

1.2.1 RNA测序数据分析：

从GEO数据库下载RNA测序数据集GSE222408、GSE218492、GSE148810和GSE148601,使用RStudio软件以及limma和edgeR等包进行差异基因分析，ggplot2、pheatmap、corplot包进行绘制相关图形。

1.2.2 细胞培养与处理：

用含10%胎牛血清的1640培养基培养THP-1细胞。以终浓度1 000 U/mL的IFN-α刺激细胞，6 h后收集细胞进行RT-qPCR检测。

1.2.3 SiRNA转染：

将THP-1细胞以5×105个/孔接种到12孔培养板中，每孔加入10 ng PMA诱导THP-1分化成巨噬细胞，24 h后更换新鲜1640培养基，每孔400 μL。将siRNA(终浓度50 pmol/L)、转染试剂RNAiMAX(3 μL)、Opti-MEM培养基(100 μL)混匀，静置5 min后，逐滴加入到细胞中，36 h后进行后续实验。利用Western blot检测干扰效率。

1.2.4 Poly(dA:dT)转染：

SiRNA转染THP-1细胞36 h后更换新鲜1640培养基，每孔400 μL。将poly(dA:dT)(2 μg/mL)、转染试剂JetPrime(2 μL)、Opti-MEM培养基(100 μL)混匀，静置15 min后，逐滴加入到细胞中。6 h后收集细胞进行RT-qPCR检测。

1.2.5 RT-qPCR检测mRNA水平：

用RNA提取试剂盒提取THP-1细胞总RNA。反转录成cDNA后，采用SYBRgreen 染料法进行RT-qPCR (95 ℃变性60 s, 56 ℃退火15 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环),检测典型Ⅰ型干扰素，以β1干扰素(interferon-beta1,IFNB1)为代表的mRNA水平，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。GAPDH引物序列：F:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,R:5′-GGCTG TTGTCATACTTCTCATGG-3′;DDX60引物序列：F:5′-CAGCTCCAATGAAATGGTGCC-3′,R:5′-CTCAGG GGTTTATGAGAATGCC-3′;IFNB1引物序列；F:5′-ATGACCAACAAGTGTCTCCTCC-3′,R:5′-GGAATCC AAGCAAGTTGTAGCTC-3′。

1.2.6 Western blot检测蛋白质表达：

裂解细胞，BCA法测定蛋白质浓度。蛋白质经变性，SDS-PAGE,转膜，封闭，一抗(抗GAPDH抗体、抗DDX60抗体)和二抗孵育，ECL法显影。

1.3 统计学分析

所有实验均经过3 次以上重复，采用R 4.2.3软件进行统计学分析，计量资料以M(P25,P75)或均数±标准差

表示，两组间差异比较采用Wilcoxon检验或t检验，相关分析采用Pearson相关，P<0.05被认为有统计学差异。

2、结果

2.1 SLE患者PBMCs高表达DDX60

从GEO数据库下载RNA测序数据集(GSE222408),对32例SLE患者和11名健康人PBMCs的测序结果进行差异分析，筛选出P<0.05、差异倍数(fold change, FC)>2或< 0.5的差异基因，包括334个上调基因，92个下调基因，其中DDX60在SLE患者PBMCs中显著高表达(P<0.01)(图1A,B)。

图1 SLE患者比健康人PBMCs中DDX60的mRNA水平升高

2.2 DDX60 mRNA水平与SLE疾病活动度正相关

DDX60在SLE患者中高表达，推测DDX60表达水平可能具有预后意义。从GEO数据库下载数据集(GSE148601),分析22例SLE患者和14名健康人的RNA测序数据和临床数据，发现SLE患者PBMCs的DDX60 mRNA水平与疾病活动度(SLEDAI)具有显著正相关关系(P<0.01)(图2A),且在治疗后有下降趋势，但差异无统计学意义(图2B)。

2.3 DDX60表达水平与IFN-Ⅰ正相关

已有研究证实DDX60是一个ISG[5]。通过分析RNA测序数据集(GSE218492)发现IFN-α可以显著增加人单核细胞表达DDX60(图3A)(P<0.01)。通过分析SLE患者损伤皮肤样本的RNA测序数据(GSE148810),发现DDX60与IFN-Ⅰ以及ISGs mRNA水平正相关(图3B)。

2.4 IFN-Ⅰ诱导表达的DDX60促进dsDNA-IFN-Ⅰ通路

检测发现，DDX60在SLE患者PBMCs中的表达显著高于健康人(P< 0.01)(图4A)。用IFN-α刺激THP-1细胞，证实IFN-α可以显著诱导DDX60表达 (P< 0.001) (图4B)。 dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ 通路参与SLE进展[6],DExD/H盒解旋酶家族成员广泛参与该通路的调控[7,8,9,10],已有研究表明DDX60促进HSV-1诱导的IFN-Ⅰ产生[11],推测DDX60可能也参与了dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ通路的调控。在THP-1细胞中沉默DDX60,转染poly(dA:dT),通过RT-qPCR检测IFNB1 mRNA水平。沉默DDX60显著降低poly(dA:dT)诱导细胞产生的IFNB1 mRNA水平(P<0.01)(图4C, D)。

图2 DDX60 mRNA水平与SLE患者疾病活动度正相关

图3 DDX60表达水平与IFN-Ⅰ正相关

3、讨论

SLE患者血清高水平的IFN-Ⅰ可以致敏外周血循环免疫细胞，显著增强组织浸润免疫细胞的效应以及IFN-Ⅰ产生，由此形成正反馈，导致病情持续进展[1,2,3,4,5]。鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)作为ISG和dsDNA受体，其介导的dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ通路是SLE病理过程的重要一环[6]。那么哪些分子参与该通路的调控，靶向该分子是否能够成为临床延缓SLE患者病情的治疗新策略，是目前该领域的研究热点。

DExD/H盒解旋酶(DExD/H box helicase)家族的经典功能是作为RNA解旋酶加工RNA,参与重要基因的表达调控，但其非经典功能例如调控免疫应答，也受到了广泛关注[7]。DDX41作为dsDNA受体介导dsDNA-DDX41-IFN-Ⅰ通路的传递[8];DDX3X与TBK1相互作用，促进细菌DNA诱导细胞产生IFN-Ⅰ[9];DDX3与IKKε相互作用，促进细胞抗病毒免疫应答[10];DDX60在病毒感染的细胞中高表达，促进RIG-I与dsRNA的结合以及IFN-Ⅰ产生[5,11]。DDX60作为ISG基因在SLE患者细胞中高表达，其生物学意义目前仍不清楚。本研究发现，DDX60受IFN-Ⅰ诱导表达，促进dsDNA-cGAS-STING-IFN-Ⅰ通路的传递，进而促进SLE的疾病进展，可作为SLE临床治疗的潜在靶点。同时DDX60表达水平与SLE疾病活动度显著正相关，且在治疗后有下降趋势，具有一定的临床诊断及预后价值。本研究拓展了对cGAS-STING通路调控、DExD/H盒解旋酶家族成员的功能以及SLE病理机制的认识。DExD/H盒解旋酶家族其他成员是否也参与了SLE的进展值得进一步研究。

Poly(dA:dT)作为dsDNA,常被用于dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ通路的研究。但也有研究表明，poly(dA:dT)可被RNA聚合酶Ⅲ转录成dsRNA,进而诱导RIG-I/MDA5-IFN-Ⅰ通路的传递[12,13];此外，TLR7过表达小鼠可以自发SLE,且TLR7功能获得性突变可以导致SLE发生[14,15];SLE患者抗RNP抗体与血清IFN-Ⅰ水平呈正相关[3];近期也有研究表明mtRNA泄露可能促进了SLE的进展[16]。综上所述，除dsDNA外，dsRNA介导的免疫反应也可能参与了SLE的病理过程，提示DDX60可能同时参与调控两条通路。有研究表明， DDX60具有结合dsDNA的能力[11],可能作为dsDNA受体介导dsDNA-DDX60-IFN-Ⅰ通路或通过相分离参与dsDNA-cGAS-STING-IFN-Ⅰ通路的调控[8,9,10],本研究未来将对可能的机制进行验证，并拟利用DDX60敲除的SLE模型小鼠进一步证明DDX60对SLE疾病进展的重要调控作用以及临床转化的可行性。

图4 IFN-Ⅰ诱导的DDX60促进dsDNA-IFN-Ⅰ通路

参考文献:

[1]曹雪涛,何维.医学免疫学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2015:319-320.

[2]孔杰,高瑛瑛,王雪琴,等.基于miRNA芯片对系统性红斑狼疮的生物信息学分析[J].基础医学与临床,2021,41:865-870.

基金资助:国家自然科学基金(82171726);

文章来源:袁勋,王宇扬,孟姝.DDX60促进系统性红斑狼疮患者PBMCs中Ⅰ型干扰素的表达[J].基础医学与临床,2024,44(07):959-964.