高脂血症又称血脂异常，是一种复杂的代谢紊乱，受到脂质合成、运输与清除之间动态平衡的影响[1]。这种病症主要表现为总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）与相关脂蛋白代谢功能紊乱[2]。在我国城乡居民疾病死亡构成比中，心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）居断层第一[3]，动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是该疾病发生和发展的主要原因，而血清TC升高与AS的发展有密切关联[4]，因此调控肝脏胆固醇代谢相关基因表达对于降低血脂水平，改善脂质代谢，从而对抗高脂血症的发展至关重要。目前，调控胆固醇代谢平衡药物已在临床中用于预防和治疗AS、癌症等疾病。如他汀类药物可竞争性抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGCR）活性进而阻碍胆固醇合成，逆转胰腺癌中的转录因子以促进胰腺癌细胞的衰老[5]等作用，但服用他汀类药物存在肝损伤、横纹肌溶解等不良反应[6]。

肝脏是胆固醇代谢的主要场所，增强胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport,RCT）和促进胆固醇转化为胆汁酸是治疗高脂血症的两条重要途径[9-11]。其中，胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1）是胆固醇代谢的关键酶[12-14]。低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor,LDLR）将低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）运送到细胞内进行分解，以维持血液中的胆固醇水平[15-16]。在细胞外途径中，PCKS9的催化域与LDLR的表皮生长因子-A (epidermal growth factor-A,EGF-A）结构域结合并形成稳定的复合物，阻止LDLR回收到细胞表面，间接导致LDL-C水平升高[17]。经过近几年的不断深入研究，PCSK9-LDLR通路在降血脂机制方面被受关注[18]。

作为国家卫生健康委员会批准的新资源食品原料，米糠脂肪烷醇具有影响胆固醇合成限速酶HMGCR的活性[19]、影响PCSK9水平[20]等作用。三七（Panax notoginseng）作为云南道地药材，其降血脂机制可能与升高CYP7A1，降低PCSK9的表达，促进肝脏对LDL-C的摄取，使血脂维持在正常的水平等作用有关[21-22]。山楂（Crataegus pinnatifida）是一种药食同源的中药材，具有消食健胃、化浊降脂[23]等功效。

前期研究表明米糠脂肪烷醇复配三七（经60%乙醇回流提取）、山楂（经50%乙醇回流提取）的中药复方具有辅助降血脂作用，但具体机制还不清楚。本文采用脂肪乳灌胃复制高脂血症大鼠模型研究该中药复方辅助降血脂的作用机制，为开发出具有辅助降血脂功能的保健产品提供新思路。

1、材料

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠36只，体质量200～220 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010，合格证号：No.110324241101430387。按照云南中医药大学动物实验伦理审查委员会的相关规定进行实验，伦理委员会审批号：R-062023210。

1.2试剂

辛伐他汀片（山东鲁抗医药集团塞特有限责任公司，批号：230501）；三七、山楂（由云南中医药大学第一附属医院中药房提供）；米糠脂肪烷醇（湖州圣涛生物技术有限公司）；胆固醇（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C80457）；丙硫氧嘧啶片（上海朝晖药业有限公司，批号：2312N10）；猪胆酸钠（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20240220）；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20240508);EastepⓇSuper总RNA提取试剂盒（北京普洛麦格生物技术公司，批号：0000565921);EastepⓇRT Master Mix Kit（上海普洛麦格生物技术公司，批号：0000555236);EastepⓇqPCR Master Mix(2X）（上海普洛麦格生物技术公司，批号：0000583641）；大鼠ACTB内参引物（上海生工生物工程公司，批号：JC20KA2386）；饱和油红O染液（Solarbio，批号：G1260）；异丙醇（生产商：天津市致远化学试剂有限公司；批号：20220501311）；苏木素染色液（武汉Servicebio生物技术有限公司，批号：CR2301055）；伊红染色液（武汉Servicebio生物技术有限公司，批号：CR2308055）。

1.3仪器

高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号SCIENTZ-48）；组织包埋机（美国Thermo Fisher公司，型号HISTOSTAR）；轮转式切片机（美国Thermo Fisher公司，型号HM 340E）；玻片扫描影像系统（深圳市生强科技有限公司，型号SQS-20Pro）；电子分析天平（德国Sartorius公司，型号BCE224I-1CCN）；台式高速离心机（湖南赫西仪器装备公司，型号H/T16MM）；酶标仪（美国MolecularDevice公司，型号SpectraMax I3X）；超微量分光光度计（美国Thermo Fisher公司，型号NanoDrop Lite);PCR扩增仪（美国Thermo Fisher公司，型号Veriti）；荧光定量PCR扩增仪（美国Thermo Fisher公司，型号QuantStudio 5）。

2、方法

2.1给药剂量

基于米糠脂肪烷醇的中药复方由三七（60%乙醇回流提取），山楂（50%乙醇回流提取），米糠脂肪烷醇组成。前期研究表明，该复方在0.723 67 g/kg（含三七0.467 g/kg、山楂0.250 g/kg、米糠脂肪烷醇6.670 mg/kg）有较显著的降血脂作用。因此，本研究在前期研究的基础上，设置中药复方高剂量组为2.171 01 g/kg（含三七1.401 g/kg、山楂0.750 g/kg、米糠脂肪烷醇20.01 mg/kg），中剂量组为0.723 67 g/kg（含三七0.467 g/kg、山楂0.250 g/kg、米糠脂肪烷醇6.670 mg/kg），低剂量组为0.362 335 g/kg（含三七0.234 g/kg、山楂0.125 g/kg、米糠脂肪烷醇3.335 mg/kg），灌胃体积为1 mL/100 g。

2.2动物分组与样品采集

36只雄性SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为正常组、模型组、阳性组（7.2mg/kg辛伐他汀）、中药复方（高、中、低剂量）组。除正常组灌胃等体积双蒸水外，其余各组每天按2 mL/100 g体重灌胃脂肪乳（40 g猪油、20 g胆固醇、1 g丙硫氧嘧啶片、20 mL吐温-80、20 mL丙二醇、20 mL10%猪胆酸钠溶液）复制高脂血症大鼠模型[24]。于造模第8天开始，每日上午灌胃脂肪乳造模，间隔10 h后，阳性组、中药复方高、中、低剂量组按1 mL/100 g灌胃给予干预药物溶液，正常组和模型组灌胃等体积双蒸水。每日监测各组大鼠空腹体重，持续4 w。

2.3体重

实验开始时称量并记录大鼠空腹体重，之后每周的最后一天称量记录大鼠空腹体重，观察各组大鼠的空腹体重变化。

2.4脏器指数

取出的大鼠肝脏、脾脏、肾脏在冰生理盐水中洗去其上多余的血液，用滤纸拭干，进行称重。计算器官指数：器官指数（%）=器官湿重（g）/动物体重（g）×100%。

2.5血脂检测

将收集的血液以3 500 rpm/min离心10 min后分离血清，参照试剂盒说明书，检测血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。

2.6肝脂检测

称量约50 mg肝右叶组织置于研磨管，加入0.9%氯化钠溶液，研磨仪内充分研磨，研磨后以3 500 r/min离心10 min，取上清液测定TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。

2.7肝脏形态学观察

取出的大鼠肝脏拍照，观察各组大鼠肝脏的形态学变化。

2.8苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠肝组织病理学改变情况

将肝组织从固定液中取出置于包埋框内，流水冲洗12 h，进行脱水、浸蜡、包埋、切片（厚度约为5μm），后按照HE染色步骤进行染色，封片晾干保存。

2.9油红O染色观察大鼠肝组织脂质沉积情况

肝组织冷冻切片干燥30 min后，用组织固定液固定15min，充分洗涤，使用60%异丙醇浸洗；油红O染色8～10 min（加盖避光），洗片后浸入苏木素复染3～5 min；染色好的组织切片用甘油明胶进行封片，在玻片扫描系统下扫描拍照后观察。

2.1 0检测各组大鼠肝脏组织中胆固醇代谢相关基因mRNA表达

参照说明书提取大鼠肝组织总RNA，收集RNA后检测其浓度，利用EastepⓇRT Master Mix Kit试剂盒逆转录获得cDNA，后按照表1步骤进行实时荧光PCR扩增，引物由上海生工合成，详见表2。

qPCR原始数据先通过QuantStudioTMDesign&Analysis Software v1.5.2软件处理后，按照①△CT=CT目的基因-CT内参，②△△CT=△CT实验组-△CT正常组，③F=2-△△CT计算实验组相对正常组mRNA表达变化。

表1 qPCR标准扩增程序

表2目的基因引物序列

2.11统计学分析

所有数据采用IBM SPSS Statistics 26进行统计分析。数据以均数±标准差表示，数据不符合正态分布采用非参数检验；符合正态分布进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析（One-way ANOVE）中的Dunnett分析，当方差不齐时采用秩合检验（Kruskal-Wallis test）。以P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1中药复方对高脂血症大鼠体重的影响

实验期间大鼠生长状况良好，随时间推移，各组大鼠体重均增加，但差异均无统计学意义，详见表3。

3.2中药复方对高脂血症大鼠脏器指数的影响

与正常组相比，模型组大鼠的脾脏指数明显降低，肝脏指数明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01），肾脏指数有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组大鼠的肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数均无明显变化。详见表4至表6。

表3中药复方对高脂血症大鼠体重的影响

表4中药复方对高脂血症模型大鼠肝脏指数的影响

表5中药复方对高脂血症模型大鼠脾脏指数的影响

表6中药复方对高脂血症模型大鼠肾脏指数的影响

3.3中药复方对高脂血症大鼠血脂的影响

与正常组相比，模型组的TC、TG、LDL-C均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.001),HDL-C有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，中药复方的高剂量组大鼠血清中TC、LDL-C含量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）；中药复方的中剂量组和低剂量组大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）。详见表7。

3.4中药复方对高脂血症大鼠肝脂的影响

与正常组相比，模型组的TC、TG、LDL-C均明显升高，HDL-C明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）；与模型组相比，中药复方的高剂量组大鼠肝脏中的TC、TG、LDL-C含量均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001),HDL-C含量有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；中药复方的中剂量组大鼠肝脏中的TC、TG、LDL-C含量有降低趋势，HDL-C含量有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；中药复方的低剂量组大鼠肝脏中的TG含量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01),TC、LDL-C含量有降低趋势，HDL-C含量有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。详见表8。

表7中药复方对高脂血症模型大鼠血脂四项的影响

表8中药复方对高脂血症模型大鼠肝脂的影响

3.5中药复方对高脂血症大鼠肝脏形态学的影响

正常组肝脏无异常变化，呈红褐色，表面光滑有光泽；模型组与正常组比较，模型组肝脏肿大，表面油腻，颜色发黄甚至发白；受试物组与模型组比较，肝脏膨大程度减轻，呈浅黄色，表面较细腻，边缘稍钝，质地偏软。详见图1。

图1中药复方对高脂血症大鼠肝脏形态学的影响

3.6中药复方对高脂血症大鼠肝组织病理学的影响

HE染色可见正常组大鼠肝小叶、肝窦结构清晰，肝细胞大小、结构、形态正常；与正常组比较，模型组大鼠肝窦变窄，肝小叶排列不正常，肝细胞肿胀且排列紊乱，细胞质内有脂肪空泡；与模型组比较，受试物组大鼠肝小叶清晰程度、肝组织脂肪空泡、肝细胞大小、结构、形态均有不同程度的改善。详见图2。

图2中药复方对高脂血症大鼠肝组织病理学的影响（HE染色，×200)

3.7中药复方对高脂血症大鼠肝组织脂质沉积的影响

油红O染色可见正常组肝细胞核染为蓝色，未出现红色脂滴；模型组肝细胞质内红色脂滴明显，弥漫分布，脂质蓄积严重；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组肝细胞脂滴均明显减少，脂质蓄积程度均减轻。详见图3。

图3中药复方对高脂血症大鼠肝组织病理学的影响（油红O染色，×200)

3.8中药复方对高脂血症模型大鼠肝脏CYP7A1mRNA的影响

与正常组相比，模型组的CYP7A1mRNA表达显著下调，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，中药复方高、中、低剂量组的CYP7A1 mRNA表达显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。详见表9。

表9中药复方对高脂血症模型大鼠肝脏CYP7A1 mRNA的影响

3.9中药复方对高脂血症模型大鼠肝脏PCSK9-LDLR信号通路mRNA的影响

与正常组相比，模型组的LDLR mRNA表达显著下调，PCSK9 mRNA表达显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.001）；与模型组相比，中药复方的高、中、低剂量组LDLR mRNA表达有上调趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；中药复方的中剂量组PCSK9 mRNA表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）；中药复方的高剂量组PCSK9 mRNA表达有下调趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。详见表10。

表1 0中药复方对高脂血症模型大鼠肝组织PCSK9-LDLR mRNA的影响

4、讨论

高脂血症是指由于机体脂质代谢紊乱或转运异常，导致血浆中一种或多种脂质结构失衡的代谢性疾病[25]，与动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD）密切相关[26]，具体表现为血液中TC、TG、LDL-C水平升高和HDL-C水平降低[27]。血浆总胆固醇水平升高是高脂血症发生的关键原因，而天然产物中的有效成分能够通过增加肝脏对胆固醇的吸收、减少肝脏内胆固醇的生成以及阻止肠道对胆固醇的吸收，从而调节血浆中的总胆固醇含量[28]。本文用脂肪乳灌胃构建大鼠高脂血症模型，经鉴定后表明模型构建成功。研究表明，复配三七、山楂、米糠脂肪烷醇的中药复方具有调节血脂的作用，与之前的研究结果一致。同时，米糠脂肪烷醇复配山楂、三七能够减少肝脏内脂质沉积，改善肝组织形态，说明该复方可有效改善高脂血症的症状。

大量临床研究表明LDL-C水平升高导致的血脂异常是ASCVD主要的危险因素之一[29]。LDLR是位于细胞膜上的蛋白质受体，在肝脏细胞上表达居多，LDL-C主要经LDLR内吞循环代谢经胆道从肠道排出体外[30]。PCSK9作为1种分泌性蛋白，主要功能是与肝细胞表面的LDLR结合，将其运送到溶酶体进行降解，造成肝脏对LDL-C摄取能力下降，导致血浆中LDL-C的水平升高[7]。CYP7A1是肝脏特异性微粒体细胞色素P450家族7亚家族A成员，在催化胆固醇转化为7α-羟基胆固醇促进胆汁酸分解反应中作为限速酶存在[31]。

综上所述，LDLR是清除血液中LDL的关键受体，PCSK9通过减少LDLR的数量来调节胆固醇水平，而CYP7A1则参与了胆固醇向胆汁酸的转化，这三者共同参与了胆固醇的代谢和调节。本文以调节肝脏胆固醇摄取和利用的关键因子PCSK9、LDLR、CYP7A1为切入点，通过脂肪乳灌胃建立高脂血症大鼠模型，评价复配中药复方是否通过增加肝脏胆固醇摄取和利用进而调节胆固醇代谢。结果显示，复配三七、山楂、米糠脂肪烷醇的中药复方具有辅助降血脂、缓解肝脏脂质沉积等作用，并能上调高脂血症大鼠肝脏CYP7A1、LDLR mRNA表达，抑制PCSK9 mRNA表达，其机制可能与调控肝脏胆固醇摄取和促进胆固醇利用有关。但本研究仅为初步探讨，基于米糠脂肪烷醇的中药复方如何影响肝脏对胆固醇吸收，是否可促进胆固醇排出等具体机理尚需深入研究和实验确认，这将成为后续研究的方向和内容。

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基金资助:云南省高校工程研究中心(2020YGG01);云南省中医药科技资源开放共享公共科技服务平台;

文章来源:陈简,颜明丽,谭晓玉,等.基于米糠脂肪烷醇的中药复方对高脂血症大鼠肝脏胆固醇代谢的影响[J].云南中医药大学学报,2024,47(04):66-74.