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多重PCR检测技术在耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌基因型中的应用
摘要：目的利用多重PCR技术检测耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌基因型。方法收集2015年1月—2018年1月某院住院患者各种临床标本(痰液、血液、尿液、腹腔引流液等)中分离得到的CRKP共132株,采用Vitek-2Compact全自动微生物鉴定仪对分离菌株进行体外药物敏感试验;利用拉丝试验筛选高粘液阳性菌株;利用改良Hodge实验对碳青霉烯酶表型进行检测;利用多重PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因型:kpc、imp、vim、ndm、sme、ges、gim、oxa-48;常见毒力基因rmpA、magA、fimH、mrkD、kpn、entB、ybtS、iutA、aerobactin。结果132株CRKP对头孢类抗生素耐药率较高,氨苄西林、氨曲南次之,对多粘菌素B、四环素、氯霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶敏感;改良Hodge试验阳性118株,阳性率89.39%;132株CRKP中,20株(15.15%)为黏液丝检测阳性。所有CRKP中毒力基因携带情况中,mrkD基因型比例最高,其次为fimH,未检测到magA毒力基因;132株CRKP中,130株检测到kmc基因,2株检测到imp基因,均未检测到ndm、vim、sme、ges、gim、oxa-48毒力基因。结论某院分离得到的CRKP主要毒力基因为mrkD、fimH,耐药基因主要为kpc。
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肺炎克雷伯菌是感染的常见病原菌，可引起呼吸道、泌尿系统感染，是重要的条件致病菌之一，可导致免疫抑制剂因长期使用抗生素而致菌群失调的人群感染[1,2]。随着近年来广谱抗生素的广泛使用，耐药的Kpn比例呈上升趋势。碳青霉烯抗生素因其抗菌谱广及抗菌活性强、毒性低等，已成为临床抗感染的首选药物。但随着该类抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯类抗生素的肺炎耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌)耐药率逐渐升高[3]。因此，对CRKP的耐药机制及基因型研究十分重要。多重PCR是在同一PCR反应体系中加入多种特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程，可一次扩增多个靶基因，实现多个基因型的鉴别或多种病原体的同时检出，具有效率高、耗时短等优点[4]。本研究利用多重PCR法对某院分离出的CRKP基因型进行鉴定，为研究本地区CRKP的耐药机制积累临床数据。
1、材料与方法
1.1菌株来源
收集2015年1月—2018年1月某院住院患者各种临床标本(痰液、血液、尿液、腹腔引流液等)中分离得到的CRKP共132株，剔除同一患者重复分离菌株。男性患者74例、女性患者58例，其中血液中分离获得79株、痰液中分离获得29株、尿液中获得10株、腹腔引流液中获得14株。本研究经医院伦理委员会批准。
1.2仪器和试剂
VITEK2compact全自动细菌鉴定仪及配套药敏卡，PCR扩增仪，VITEK比浊仪，凝胶成像系统，药敏纸片及MH琼脂粉为英国OXOID公司产品。
1.3方法
1.3.1菌株鉴定及药敏试验
将筛选出的菌株复苏后传代培养，挑取单菌落研磨，配制为0.5麦氏浊度的菌液，放入GN鉴定卡，上机检测，观察结果与系统数据库比对得到最终鉴定结果；采用Vitek-2Compact全自动微生物鉴定仪对分离菌株进行体外药物敏感试验，参照美国临床和实验室标准协会(AmericanSocietyforClinicalandLaboratoryStandards,CLSI)规定标准[5],美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)标准[6]判读替加环素敏感性。
1.3.2拉丝试验
将本研究的CRKP菌株转划至血琼脂平板，利用接种环蘸取菌落，将接种环向上轻轻提取，若形成黏液丝长度≥0.5cm则为拉丝试验阳性，以上操作重复三次均为阳性者为高黏液表型菌株。
1.3.3碳青霉烯酶表型检测
改良Hodge实验：将配制好的0.5麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC25922菌液用生理盐水1∶10稀释，将菌液均匀涂布于MH平板培养基，使平板干燥10min后在培养基中央放置美罗培南纸片，挑选3～5个待测菌株或是质控菌株垂直于纸片，自纸片外缘向外划线直线，以ATCCBAA1705为阳性对照、ATCCBAA1706为阴性对照，35℃培养孵育16～20h。评价标准：待测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌圈交界处出现向内增强生长，抑菌圈不规则，表明该待测菌种为碳青霉烯酶菌株。
1.3.4多重PCR检测耐药基因及毒力基因
采用煮沸法提取受试菌株DNA,参照文献报道多重引物，利用多重PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因型：kpc、imp、vim、ndm、sme、ges、gim、oxa-48;常见毒力基因rmpA、magA、fimH、mrkD、kpn、entB、ybtS、iutA、aerobactin。引物、反应体系及反应条件参考Boutal等[7]文献。
2、结果
2.1药敏试验检测结果
本研究132株CRKP中，对头孢类抗生素耐药率较高，氨苄西林、氨曲南次之，对多粘菌素B、四环素、氯霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶敏感。见表1。
2.2碳青霉烯酶表型检测结果
改良Hodge试验阳性118株，阳性率89.39%。见图1。
2.3多重PCR检测CRKP毒力基因型结果
本研究132株CRKP中，20株(15.15%)为黏液丝检测阳性。所有CRKP中毒力基因携带情况见表2。其中mrkD基因型比例最高，其次为fimH,未检测到magA毒力基因。
2.4多重PCR检测CRKP耐药基因结果
132株CRKP的PCR扩增产物经测序比对后发现，130株菌株中检测到kpc基因，2株检测到imp基因，均未检测到ndm、vim、sme、ges、gim、oxa-48毒力基因。见表3。
3、讨论
Kpn是我国重症监护病房患者主要感染病原菌之一，且近年来由其引发的感染致病率呈上升趋势。研究显示，重症监护病房患者感染的Kpn常对临床广泛使用的头孢菌素类、青霉素类抗生素耐药，且多携带有其他多种耐药基因，给临床治疗带来巨大威胁[8]。因此，研究CRKP的耐药机制具有重要作用。CRKP最主要的耐药机制即为产生碳青霉烯水解酶，在我国，CRKP以产kpc型碳青霉烯酶为主[9]。本研究体外药敏试验结果表明，CRKP对头孢菌素类、碳青霉烯类、氨曲南等含酶抑制剂抗生素耐药率较高，而对多粘菌素B、四环素、氯霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶敏感等药物敏感，提示某院可使用上述抗生素进行抗感染治疗。近年来，关于多粘菌素的耐药性报道逐渐增多[10],单类抗生素治疗携带kpc基因的Kpn易产生耐药性，因此在该院后续治疗时可选择使用上述抗生素联合治疗，避免产生耐药性。黏液丝试验阳性是高危型CRKP的特点，本研究共筛选出CRKP高黏菌株20株，占菌株总数的15.15%,与高倩倩等[11]报道相近，提示医院内分离的CRKP高毒性菌株比例相对较低，CRKP菌株的高毒性与耐药性之间可能不存在相关性。
近些年随着诊断技术的发展，PCR法在疾病诊断中的应用不断扩大，通过对EBV-DNA的定量检测作为感染的分子生物学标记，并结合PCR技术的快速、灵敏、准确的特点。PCR技术是由引物介导的体外酶促DNA扩增技术，具有敏感、特异、易于自动化操作等优点，在生命科学的各个领域得到广泛应用。多重PCR技术是在单基因PCR基础上发展起来的，可一次扩增多个靶基因，多个基因型鉴别或多种病原体同时检出。多重PCR成本低、操作简便、假阳性率低，检验效率大大提升[12]。本研究利用多重PCR技术检测CRKP基因型，研究结果显示，携带粘液表型调控基因rmpA共29株(21.97%),与黏液丝试验结果不符，李喜红等[13]研究结果显示，携带rmpA菌株并不一定表现高黏性，其高黏表型可能还受其它调控因子影响；magA是另一个与高粘性表达有关的毒力因子，本研究中未检测到magA毒力基因，与Cubero等[14]研究结果一致，高粘表型调控的具体机制有待进一步研究。所有CRKP毒力基因携带情况中，mrkD基因型比例最高，其次为fimH。已有报道显示，mrkD作为Kpn的粘附因子基因，可编码粘附蛋白，介导Kpn粘附，与细菌侵袭宿主的能力有关[15];fimH基因是介导Ⅰ型菌毛的基因，与细菌粘附有关[16],在细菌感染中发挥重要作用，本研究结果与王欢欢等[16]一致，提示fimH、mrkD是CRKP重要的毒力基因。
CRKP主要的耐药机制为携带产酶的相关耐药基因，这些耐药基因位于染色体、质粒及其他遗传元件上。而在碳青霉烯酶中以kpc型碳青霉烯酶为主，在我国以kpc-2最为流行[17]。kpc属于碳青霉烯酶A类丝氨酸酶，其活性不受β-内酰胺酶抑制剂及EDTA抑制剂抑制[18]。kpc耐药基因由于位于可移动质粒上，传播能力较强，因此kpc性菌株往往多重耐药，携带kpc基因的高耐药且高毒力菌株将会给治疗带来极大困难。该院在130株(98.48%)菌株中检测到kpc基因，2株(1.52%)菌株中检测到imp基因，均未检测到ndm、vim、sme、ges、gim、oxa-48毒力基因，与我国主要流行分布基因型一致。本研究结果显示改良Hodge试验中118株为阳性(89.39%),与多重PCR结果有一定差异，推测可能是由于部分菌株产碳青霉烯酶量少，出现观察结果假阴性。
综上所述，某院分离得到的CRKP主要毒力基因为mrkD、fimH,耐药基因主要为kpc。本研究不足之处：CRKP的耐药机制除了产生碳青霉烯酶外，还可能与膜孔蛋白基因缺失、产生ampC头孢菌素酶有关[19],本研究仅对产碳青霉烯酶相关耐药基因做了多重PCR扩增测序，且本次研究中CRKP血液来源比例较高，可能对研究结果造成一定偏倚，将在后续研究中丰富样本类型，深入研究。
利益冲突无
参考文献：
[1]胡洁，舒玲斌，孙巧玲，等.急性腹泻患者肠道分离肺炎克雷伯菌耐药及毒力流行病学研究[J].中华急诊医学杂志，2018.27(11)1281-1284.
[2]戴尔宽，史玮炀，刘洋，等.108株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的临床分布与耐药基因研究[J.中国抗生素杂志，2017,42(3):218-224.
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[4]胡肿，马薇，张可昕，等.多重PCR方法快速检测血流感染10种常见病原菌方法的建立与应用[UJ].中华医院感染学杂志，2018,28(7):961-965,978.
文章来源：严宏,严华,孙建斌,戚勇,李军,蒋雯,陈雯雯.多重PCR检测技术在耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌基因型中的应用[J].医学动物防制,2021,37(10):951-954.
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期刊名称：临床内科杂志
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主管单位：湖北省卫生健康委员会
主办单位：中华医学会湖北分会
出版地方：湖北
专业分类：医学
国际刊号：1001-9057
国内刊号：42-1139/R
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创刊时间：1984年
发行周期：月刊
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