首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 内科职称论文 > 二甲双胍通过mTOR信号通路调节自噬减轻小鼠心肌梗死损伤中的作用

二甲双胍通过mTOR信号通路调节自噬减轻小鼠心肌梗死损伤中的作用

2020-09-01 587 上传者：管理员

摘要：目的通过在体实验探究二甲双胍(Met)通过mTOR信号通路调节自噬减轻小鼠心肌梗死(MI)损伤中的作用。方法将80只8周龄C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham组)、单纯二甲双胍[300 mg/(kg·d)]处理组(Met组)、MI组和二甲双胍[300 mg/(kg·d)]干预MI组(MI+Met组)。采用冠状动脉左前降支结扎术制备MI模型,计算模型各组死亡率差别,绘制生存分析曲线,HE染色观察心肌组织形态学变化,试剂盒检测各组血清中肌酸激酶同工酶(CKMB)的含量,TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况,蛋白印迹法(Western-blot)检测自噬相关蛋白p62、Beclin1和mTOR磷酸化的表达,免疫荧光染色法检测LC3B的表达。结果与Sham组相比,Met组各项指标均无明显变化;MI组心肌纤维断裂明显、排列紊乱,纤维化程度增加、血清中CKMB含量明显增加(P<0.05)、TUNEL阳性细胞明显增多(P<0.05)、Beclin1表达显著升高(P<0.05)、磷酸化mTOR的表达降低(P<0.05)、p62表达显著降低(P<0.05)、免疫荧光结果显示LC3B表达增加(P<0.05); Met+MI组可明显减轻心肌纤维的断裂及纤维化、降低血清中CKMB含量(P<0.05)、减少TUNEL阳性细胞数(P<0.05)、减少Beclin1的表达(P<0.05)、降低免疫荧光染色中LC3B的表达(P<0.05)。结论二甲双胍通过调节mTOR信号介导的自噬可减轻小鼠心脏MI损伤。

关键词：
mTOR
二甲双胍
小鼠
心肌损伤
心肌梗死
自噬
加入收藏

缺血性心脏病严重威胁着人类健康,其中冠状动脉阻塞导致的心肌梗死(myocardial infarction, MI)造成心肌细胞不可逆转坏死。近年来,随着心血管介入技术的不断发展,大大增加了患者心梗后的存活率,而梗死后并发症导致的心功能下降却越来越普遍[1]。如何进一步减轻心梗后心肌损伤、改善心功能成为心脏康复研究的重要领域。既往研究表明心梗损伤机制与炎症刺激、氧化应激反应、凋亡等相关,最新研究表明心肌细胞的mTOR信号通路介导的自噬在MI后心室重构中发挥重要作用[2,3,4,5,6]。二甲双胍(metformin,Met)以往在临床上作为降糖药用于治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),近年来不断有文献报道其多样性应用研究,研究发现缺血性心脏病、糖尿病伴心力衰竭的患者使用二甲双胍安全有效[7,8,9]。Met通过信号分子的调控改善心肌功能、发挥心脏保护作用的研究也越来越多[10,11,12]。本实验在小鼠MI模型中发现,Met可以通过调节Akt/mTOR信号通路来下调自噬水平减轻MI后心肌损伤,从而为Met用于MI的临床应用积累更多的实验依据。

1、材料和方法

1.1仪器设备及材料

激光共聚焦显微镜、光学显微镜(奥林巴斯公司,日本),Western blot电泳设备(Bio-Rad公司,美国)。C57BL/6小鼠(健康,雄性,8周龄)80只,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司。Met(Sigma公司,美国),辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、mTOR、磷酸化mTOR (mammalian target of rapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、p62、LC3B和Beclin1(Abcom公司,美国),TUNEL试剂盒购(Roche公司),肌酸激酶同工酶(creatine kinase, CKMB)试剂盒(R&D公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠MI模型建立

异氟烷麻醉后,固定(仰卧位),连接心电图电极,记录心电图。开胸暴露后,在小鼠心脏左心耳下方2～3 mm处以6-0号线结扎。心电图II导联ST段抬高,结扎线下心肌缺血,模型建立成功。假手术组仅开胸暴露。所有小鼠随机分4组,即假手术组(Sham组)、单纯二甲双胍[300 mg/(kg·d)]处理组(Met组)、MI组和Met[300 mg/(kg·d)]干预MI组(Met+MI组)。Met组和Met+MI组小鼠手术后以灌胃方式给予Met[300 mg/(kg·d)]至术后1月,Sham组和MI组手术后不做任何干预,记录并计算各组小鼠死亡率,绘制生存曲线。

1.2.1 HE染色

MI建立1月后,迅速剪下心脏,冷PBS缓冲液冲洗, 40 g/L多聚甲醛固定72 h,石蜡包埋、切片及染色。

1.2.3 CKMB检测

MI建立后3 d,异氟烷麻醉,快速取小鼠颈动脉血至4 ml EP管中,4℃低温静置8 h后,3 000 r/min离心15 min,取上清即为血清。严格按照CKMB试剂盒说明书检测各组血清中CKMB的含量,结果以U/L为单位表示。

1.2.4 TUNEL染色

切取小鼠左室前壁组织,石蜡包埋、切片、脱蜡、复水,按TUNEL试剂盒说明书检测,采集图像。每张切片随机选取10个高倍镜视野计算细胞凋亡指数(apoptotic index, AI),凋亡细胞核为绿色,正常细胞核为蓝色。AI=(凋亡细胞核数/总细胞核数)×100%。

1.2.5 LC3B免疫荧光染色

切取小鼠左室前壁组织,石蜡包埋、切片、脱蜡、复水,用PBS缓冲溶液洗5次(3 min/次),Triton-X100(2 g/L)处理15 min,PBS液冲洗5次(3 min/次),山羊血清室温封闭1.5 h,PBS液洗5次(3 min/次),每个切片加LC3B抗体(1∶100)50μl,4℃孵育15 h, PBS液洗5次(3 min/次),暗室内每张切片加荧光二抗(1∶500) 50μl,PBS液洗5次(3 min/次),避光条件下每张切片加DAPI溶液50μl,PBS液洗5次( 3 min/次),用荧光防淬灭液封片,采集图像。

1.2.6 Western-blot检测

切取小鼠左心室前壁组织50 mg,加入裂解液后低温研磨裂解30 min,离心20 min(4℃,12 000 g),取上清,定量采用BCA比色法。分别配置80 ml/L、100 ml/L和120 ml/L的分离胶进行电泳,转膜至PVDF膜上,牛奶常温封闭2 h,切下目的条带,放入相应的mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、Beclin1(1∶1 000)、p62(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)一抗中,4℃孵育过夜,再用TBST溶液洗膜5次(3 min/次),二抗常温孵育2 h,TBST洗膜5次(3 min/次),以GAPDH为内参,发光液显色,采集图像。

1.3统计学处理GraphPad Prism

5.0进行统计学分析并作图,数据以均数±标准差(x¯±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1对小鼠生存分析曲线的影响

各组小鼠4周后的生存率Kaplane-Meier分析表明MI+Met组比MI组的死亡率明显降低(P<0.05),主要死亡原因与心梗后心力衰竭有关,见图1。

图1各组小鼠生存分析曲线

2.1血清CKMB含量的变化

Sham组与Met组血清CKMB水平比较没有明显差异(P>0.05);与Sham组相比,MI组血清CKMB水平明显升高(P<0.05);Met+MI组血清中CKMB水平比MI组显著降低(P<0.05)。见图2。

2.3心肌组织TUNEL染色

Sham组与Met+Sham组TUNEL阳性细胞核染色较少且无差异(P>0.05);,MI组比Sham组TUNEL阳性细胞核染色数量明显增多(P<0.05);与MI组相比,Met+MI组可明显减少TUNEL阳性细胞核染色数量(P<0.05)。见图3。

图2血清中CKMB的含量

2.4各组小鼠心肌自噬相关蛋白表达的变化

Sham组与Met组自噬相关蛋白的含量无差异(P>0.05);MI组比Sham组p-mTOR表达明显降低(P<0.05),Beclin1、p62含量显著增高(P<0.05);MI+Met组比MI组的p-mTOR的含量显著升高(P<0.05),Beclin1、p62含量显著显著降低(P<0.05)。见图4。

2.5心肌LC3B表达的免疫荧光染色

与Sham组相比,Met组LC3B蛋白免疫荧光染色无统计学差异;与Sham组相比,MI组LC3B蛋白免疫荧光染色数量明显增多(P<0.05);与MI组相比, MI+Met组LC3B蛋白染色的数量显著减少(P<0.05),见图5。

图3各组小鼠心肌组织TUNEL染色和凋亡率

图4各组自噬相关蛋白表达的变化

图5小鼠心肌组织LC3B免疫荧光染色

3、讨论

急性MI是常见的心血管急危重症,起病较为隐袭,且具有高死亡率,目前多数入院患者行经皮冠状动脉支架植入术(percutaneous coronary stent implantatio,PCI)后,症状能够明显缓解,术后心功能明显改善。然而,MI后的心肌损伤造成心功能下降,限制PCI术后的效果[13]。本研究建立小鼠MI模型,探究MI损伤相关指标和自噬相关指标变化,结果提示,MI组心肌损伤加重、mTOR的磷酸化表达被明显抑制,并伴有自噬增强。给予Met处理后,心肌损伤明显减轻、mTOR的磷酸化表达增强,且伴有自噬降低。上述结果提示,MI损伤中,由mTOR信号通路介导的自噬发挥重要作用。本实验中,Met通过激活mTOR信号通路、降低自噬,从而减轻MI造成的心肌损伤。

正常生理状态下,自噬的作用是清除受损细胞器、错误折叠的蛋白质、维持细胞稳态,广泛存在于细胞内[14]。mTOR作为PI3K相关激酶家族成员及PI3K/Akt信号通路下游分子,参与多种生物学过程,是自噬的调控中的关键分子,且与自噬过程呈负相关,mTOR根据与其结合的蛋白质复合体的不同主要分为mTORC1与mTORC2,前者主要调节细胞能量代谢及蛋白合成。本实验结果提示,在小鼠MI模型中,p-mTOR表达降低,自噬相关蛋白Beclin1和LC3B表达增加,p62表达降低;而mTOR被激活即p-mTOR表达增高时,自噬相关蛋白Beclin1和LC3B表达减少,p62表达增加,提示mTOR信号通路介导自噬与小鼠MI模型心肌损伤密切相关。

Met是治疗T2DM的重要降糖药物,以往专家共识中明确指出:可以将Met列入T2DM患者的第一步治疗中,即在单纯饮食控制和体育锻炼的同时接受Met治疗[1]。近年来,关于Met的研究不断拓展到其他领域,研究发现能够抑制T2DM患者消化系统及泌尿系统肿瘤的进程并改善预后,同时对于肿瘤治疗,还可以增强化疗疗效,但其具体作用机制尚未完全阐明。Met可以有效降低糖尿病相关心脏疾病风险,其心血管保护机制降糖、代谢改变以及细胞功能改善等相关[15,16,17,18]。本实验发现Met在减轻心血管损伤中发挥保护作用,其机制可能与自噬过程密切相关。Met可明显改善MI后心肌纤维化程度及心肌细胞凋亡,减少血清中梗死标志物CKMB的含量,结果证实了Met减轻MI损伤的作用;同时,笔者还发现,Met组自噬相关蛋白的表达与Sham组均无明显变化;与Sham组相比,MI组p-mTOR表达明显降低,LC3B和Beclin1的表达显著升高,p62表达降低;MI+Met组p-mTOR的表达比MI组明显增高,自噬相关蛋白LC3B、Beclin1的表达显著降低,p62表达升高,表明Met可以激活mTOR信号降低自噬改善MI损伤。初步认为MI心肌缺血抑制mTOR信号通路的激活;Met通过激活mTOR信号通路下调自噬水平减轻MI损伤。

根据以上实验研究结果,本研究已经证实Met通过激活mTOR信号通路下调自噬减轻MI损伤,为Met在MI中发挥保护作用提供了新的实验依据。然而,Met激活mTOR信号通路向下调MI自噬具体机制仍有待进一步研究证实。

参考文献：

[5]徐臣年,尹文超,王建浩,等.褪黑素通过Akt/mTOR信号通路对自噬和H9C2心肌细胞缺血再灌注损伤的影响[J].解放军医药杂志,2019,31(3):8-14.

[6]徐臣年,吕涛,李聪叶,等.mTOR信号介导的自噬在褪黑素减轻心脏缺血/再灌注损伤中的作用[J].心脏杂志,2018,30(3):249-253.

徐志成,张久旭,张景智,孙腾飞,姜晓华,宋春霞.二甲双胍通过mTOR信号通路调节自噬减轻心肌梗死小鼠心肌损伤[J].中国体外循环杂志,2020,18(04):243-247.