脓毒症(sepsis)是机体感染反应失调而引起的全身炎症反应综合征，可导致多器官功能障碍。肾脏是脓毒症常累及的靶器官之一，较危重的并发症是急性肾损伤(AKI)[1]。研究显示，脓毒症患者中AKI的发生率为45%～70%,而且脓毒症引发的AKI患者的病死率显著高于其他原因引起的AKI患者[2]。针对脓毒症引发的AKI,目前临床治疗主要依赖于早期抗感染治疗及晚期肾脏替代疗法，但这些治疗效果依旧不尽人意，高致死率成为一大难题，严重影响患者家庭的生活质量和经济状况，同时，也加大了社会医疗系统的负担[3]。因此，发掘新的有效药物治疗策略，以改善脓毒症AKI患者的治疗效果和预后，已成为急需解决的问题。

小檗胺(berbamine, BBM)是一种在小檗属植物中广泛存在的天然化合物，具备多种药理作用[4]。有研究揭示，盐酸小檗胺通过抑制NF-κB炎症信号通路，减少肾脏组织中炎症介质的释放，从而缓解糖尿病肾病小鼠模型的炎症损伤[5]。然而，盐酸小檗胺对于脓毒症引起的AKI的具体治疗机制尚未明确。因此，本研究采用LPS诱导的脓毒症AKI小鼠模型，旨在深入探讨盐酸小檗胺对脓毒症AKI的保护效应及其潜在的分子机制。

1、材料与方法

1.1材料及试剂

盐酸小檗胺(上海源叶，B21448);脂多糖LPS(北京索莱宝，L8880);Nrf2抗体(ABclonal, A21176);HO-1抗体(Abcam, ab82585);p-NF-κB抗体(ABclonal, A2574);TNF-α(Proteintech, 26405);IL-6(Servicebio, GB11117);IL-1β(Servicebio, GB115602);NF-κB p65(Servicebio, GB11997);β-actin抗兔抗体(ABclonal, AC026)及HRP标记的山羊抗兔IgG(Servicebio, GB23303);MDA试剂盒、SOD试剂盒购自南京建成生物公司。

1.2实验仪器

电泳槽、电转膜仪、化学发光凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司);研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

1.3方 法

1.3.1动物实验

在特定病原体自由(SPF)级别的动物实验室内，24只C57小鼠经过一周的适应性喂养后，被随机分配至4个实验组，每组各6只，分别为空白对照组(CON)、模型组(LPS)、盐酸小檗胺治疗组(LPS+BBM)和盐酸小檗胺对照组(BBM)。CON组小鼠通过口腔灌胃方式接受生理盐水处理(10mg/kg);LPS组通过腹腔注射脂多糖(10mg/kg)来诱发脓毒症AKI模型；LPS+BBM组在诱导模型前6天每天口服灌胃盐酸小檗胺(80mg/kg),第6天腹腔注射脂多糖(10mg/kg);BBM组连续7天每天口服灌胃盐酸小檗胺(80mg/kg)。所有小鼠在最后一次给药后12h被处死，随后收集组织样本进行标记，其中一部分样本置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余样本保存于-80℃的冰箱中，待后续实验使用。

1.3.2肾组织病理损伤观察

取1.3.1中甲醛固定的小鼠肾组织经脱水、石蜡包埋后切片，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色。光学显微镜观察并根据肾小球、肾小管以及肾间质的损伤情况进行肾损伤评分，并采用0至4分进行量化：0分对应无损伤，即肾脏组织结构未见明显异常；1分代表轻微损伤(损伤比例<25%),表现为肾间质轻度炎性细胞浸润；2分指中等损伤(损伤比例25%～50%),肾间质炎症细胞明显增多，并伴有肾小管肿胀；3分表示重度损伤(损伤比例50%～75%),特征为广泛的炎症损伤影响到整个肾小球；4分对应极度重度损伤(损伤比例≥75%),此时肾间质出现显著的炎性浸润，并在肾小球内观察到炎性颗粒。

1.3.3肾组织中SOD活力与MDA含量的测定

取一部分小鼠肾脏组织，称重。随后，将肾组织与9倍量的生理盐水混合，制备成10%的组织匀浆混合液。在2500rpm下离心10min,取上清，用生理盐水将其稀释至适宜的取样浓度。操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4各组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1及p-NF-κB蛋白表达水平

取适量的肾组织，称重，依照体积比例(肾组织∶RIPA缓冲液=1∶25)添加含有PMSF和磷酸酶抑制剂A、B的RIPA裂解缓冲液(RIPA∶PMSF∶A∶B=100∶1∶1∶1)。随后，将肾组织剪碎并在冰上裂解30min,利用研磨仪将组织匀浆，并低温高速离心分离，收集上清液。使用酶标仪在562nm波长下测得肾组织的蛋白浓度，通过BCA试剂盒对蛋白进行定量。定量得到的各组蛋白样本，取12μL进行SDS-PAGE电泳，使用8%至15%的梯度凝胶分离蛋白，PVDF膜转膜150min,室温5%脱脂奶粉封闭60min,随后用增强型化学发光(ECL)显影。使用凝胶成像系统分析Nrf2、HO-1及NF-κB蛋白的表达情况。

1.3.5免疫荧光法检测各组小鼠肾脏组织中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子及NF-κB p65蛋白的荧光表达

将1.3.2中制作的石蜡切片，经脱蜡水化、抗原修复、封闭、一抗及二抗分别孵育、清洗后，复染核并避光用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察并采集图像。各组的图像采集设置相同。

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0软件处理数据，所有数据均采用表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 BBM对各组小鼠肾组织病理学改变的影响

HE染色结果表明，在CON组中，肾组织结构保持正常，未观察到炎性浸润及坏死现象；与CON组相比，LPS组的肾组织结构显示出重度异常，视野内大量肾小球内系膜细胞减少，毛细血管袢结构不清晰(红色箭头所示),大量肾小管管腔结构亦不清晰，上皮细胞数量明显减少(绿色箭头所示),肾小管内刷状缘脱落(蓝色箭头所示),间质内可见大量炎症细胞浸润(黄色箭头所示)。此外，LPS+BBM组的肾组织结构表现为中度异常，部分肾小管管腔结构不清晰，受损上皮细胞数量减少(绿色箭头所示),部分肾小管内刷状缘脱落(蓝色箭头所示),间质内可见少量炎症细胞浸润(黄色箭头所示)。BBM组的肾组织结构则基本正常。以上说明BBM显著抑制了LPS引起的肾组织病理学改变。

与CON组相比，LPS组的肾损伤评分显著升高(P<0.001);与LPS组相比，LPS+BBM组的肾损伤评分有所下降(P<0.05),BBM组肾损伤评分明显下降(P<0.001);CON组与LPS+BBM组肾损伤评分无显著差异(P>0.05)。病理切片的显微结构以及肾损伤评分的柱状图展示均见图1。

图1盐酸小檗胺对脓毒症AKI小鼠肾组织病理损伤改变及评分的影响(×20)

与CON组相比，***P<0.001;与LPS相比，*P<0.05,***P<0.001;n=6。

2.2 BBM对各组小鼠肾组织MDA含量和SOD活力的影响

与CON组相比，LPS组小鼠肾组织MDA含量升高(P<0.05),且SOD活力显著降低(P<0.01);与LPS组相比，LPS+BBM组小鼠肾组织MDA含量降低，SOD活力升高(P均<0.05)。表明BBM可显著缓解LPS引起的氧化应激，结果见表1。

表1盐酸小檗胺对脓毒症AKI小鼠肾组织MDA含量与SOD活力的影响(n=6)

2.3 BBM对各组小鼠肾组织的炎症蛋白因子免疫荧光的影响

免疫荧光分析结果表明，相较于CON组，LPS组炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)及炎症通路标志物NF-κB p65的荧光信号显著增强。然而，与LPS组比较，LPS+BBM组中这些炎症因子的荧光强度显著降低，表明盐酸小檗胺能有效抑制LPS诱导的炎症反应。如图2。

图2盐酸小檗胺对各组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB p65蛋白免疫荧光强度的影响(×200)

与CON组相比，****P<0.0001;与LPS组相比，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;n=6。

2.4 BBM对Nrf2及HO-1蛋白表达的影响

Western blot结果表明，与CON组相比，LPS组的小鼠肾组织中Nrf2和HO-1的表达显著下降(P<0.05)。与LPS组相比较，LPS+BBM组Nrf2和HO-1的表达水平显著增加(P<0.05,P<0.01)。表明盐酸小檗胺能够有效逆转脂多糖引起的氧化应激反应，通过调节Nrf2、HO-1蛋白的表达来发挥作用。如图3。

图3盐酸小檗胺对脓毒症AKI小鼠肾组织中Nrf2及HO-1蛋白的影响

与CON相比，*P<0.05;与LPS相比，#P<0.05,##P<0.01;n=6。

2.5 BBM对p-NF-κB蛋白表达的影响

Western blot分析结果表明，与CON组相比，LPS组小鼠肾组织中磷酸化NF-κB(p-NF-κB)蛋白的表达水平显著上升，该差异具有统计学意义(P<0.01)。相较于LPS组，LPS+BBM组p-NF-κB蛋白的表达水平显著下降(P<0.01),表明盐酸小檗胺能有效抑制LPS引起的NF-κB通路的激活。如图4。

图4盐酸小檗胺对脓毒症AKI小鼠肾组织中p-NF-κB蛋白的影响

与CON组相比，**P<0.01;与LPS组相比，##P<0.01;n=6。

3、讨 论

脓毒症急性肾损伤(SA-AKI)是侵入机体血液循环的内外源毒素对肾组织的损害，其临床表现包括肾小球滤过率急剧下降、氮质代谢产物累积以及电解质与酸碱平衡的失调[6]。由于SA-AKI的病理生理过程十分复杂，使其成为急诊和重症监护病房中的一个重要关注点[7]。近来的研究逐渐揭示了氧化应激和炎症反应是SA-AKI发生发展的重要因素，这两个过程常同时出现[8]。因此，能够挖掘多靶点、多通路的药物，减轻这两种生物学过程，将为SA-AKI的治疗提供新的策略。

研究表明，炎症反应在SA-AKI的发展中扮演着关键角色[9]。NF-κB是调控炎症级联反应的核心转录因子，当细胞遭受病毒、脂多糖、紫外线或免疫刺激时，NF-κB抑制蛋白覆盖的p65亚基核定位序列被磷酸化，导致NF-κB从细胞质转移到细胞核，促进下游炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的释放。因此，抑制NF-κB通路的活化是治疗策略的关键。研究发现，吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)通过抑制NF-κB信号通路的活化，减少血清中炎症因子的浓度，来有效预防LPS诱导的脓毒症AKI[10]。此外，在肾缺血再灌注(IRI)模型中，吡格列酮通过提升PPAR-γ蛋白表达抑制NF-κB蛋白活化，改善肾组织炎症损伤[11]。石磊等[12]研究发现BBM能够通过降低糖尿病肾病大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA含量，缓解糖尿病肾病损伤。本研究显示，在LPS诱导的脓毒症AKI小鼠体内，炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β的荧光表达明显增强，NF-κB通路活化，NF-κB p65转位入核，介导了脓毒症AKI的炎症反应；而在LPS+BBM组中，BBM预处理显著降低了TNF-α、IL-6、IL-1β及NF-κB p65炎症蛋白的荧光表达强度，减轻肾组织炎症损伤。

氧化应激在SA-AKI中起着至关重要的作用。当机体遭受内外源性毒素刺激时，过量生成的活性氧(ROS)超过了组织的抗氧化清除能力，导致抗氧化与氧化系统间的平衡失调。这种失衡状态引发大量氧自由基的产生，破坏了机体的抗氧化酶系统，进而降低了抗氧化酶的活性。超氧化物歧化酶(SOD)作为体内重要的抗氧化酶之一，能够促进氧自由基的歧化反应，减轻对抗氧化酶系统的损害；而丙二醛(MDA)作为脂质过氧化的重要产物，其含量的增减直接反映了氧化应激损伤的程度。因此，SOD活性与MDA含量常用于评估氧化应激损伤的程度[13]。本研究显示，LPS组小鼠肾间质出现大量炎性浸润，肾小管发生严重肿胀，肾小球内可见炎症颗粒，肾组织中SOD活性下降而MDA含量升高。然而，在LPS+BBM组中，BBM预处理显著提高了SOD活性，降低了MDA含量，并减轻了肾组织的炎性浸润，提示BBM能有效缓解肾组织氧化应激及病理损伤。

在脓毒症AKI中，炎症和氧化应激之间存在显著的交互作用。核转录因子E2相关因子2(Nrf2)及其下游靶基因血红素加氧酶-1(HO-1)构成的Nrf2/HO-1信号通路，是组织应对氧化应激的主要通路。在生理条件下，Nrf2以较低的转录活性在细胞质内与Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)复合体形式存在，一旦遭遇氧化应激，Nrf2被释放并迁移到细胞核，激活HO-1等抗氧化酶的表达，从而发挥抗氧化和抗炎作用。而NF-κB通路在氧化应激环境中易于被激活，进而促进炎症因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)的释放，加剧组织损伤[14]。本研究中，Western blot显示，LPS组中p-NF-κB蛋白激活与Nrf2/HO-1蛋白表达水平的下调，提示了炎症和氧化应激在SA-AKI中协同存在。LPS+BBM组中，BBM预处理不仅抑制了NF-κB的活化，也显著提升了Nrf2及HO-1的蛋白表达水平，表明BBM能通过调控氧化应激和炎症通路平衡对SA-AKI发挥保护作用。

综上所述，本研究证实了BBM对SA-AKI具有显著的保护作用，其作用机制涉及抑制NF-κB通路的激活并下调炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及白细胞介素1β(IL-1β)的表达。同时，BBM还能够上调核转录因子E2相关因子2(Nrf2)及其下游血红素加氧酶-1(HO-1)的蛋白表达。这一发现为更好开发BBM作为SA-AKI临床治疗方案提供了科学依据。

参考文献:

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2020:327

[5]金磊.盐酸小檗胺防治2型糖尿病肾病的作用及机制的研究[D].辽宁:辽宁大学,2020

[8]曾江维,张梦新,冯凯,等.脓毒症相关性急性肾损伤研究进展[J].华北理工大学学报(医学版),2024,26(1):78

[10]徐达良.益母草碱对脓毒症小鼠肾损伤的保护作用及机制研究[D].安徽:安徽医科大学,2016

[12]石磊,向海燕,朱玲华.小檗胺对糖尿病肾病大鼠肾损伤和炎性细胞因子产生的影响[J].免疫学杂志,2020,36(7):599

文章来源:孙珊珊,何昂,马谣谣,等.盐酸小檗胺对脓毒症急性肾损伤小鼠的保护机制研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(06):477-481.