脓毒症（sepsis,SEP）指的是人体对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，其可累及多种脏器，是一种复杂的全身炎症反应综合征[1]。一项流行病学研究，显示全球每年约有5000万新发脓毒症病例，目前尚未有完全有效的手段治疗脓毒症，其病死率接近25%，其已成为全球公共卫生的重大负担之一[2]。虽然近年来脓毒症有关的研究取得了较好的进展[3-4]，但是脓毒症发病机制尚未被完全明确，因此探究脓毒症的潜在机制和诊断标志物，对于寻找脓毒症的治疗靶点、改善患者预后方面有重要意义。

双硫死亡是2023年由甘波谊[5]首次报道的一种全新的细胞死亡方式，即在细胞内葡萄糖缺乏的条件下，SLC7A11高表达的细胞中细胞内二硫化物分子会异常过度积累从而导致细胞死亡，由于这种细胞死亡形式的特点是二硫化物应激，故名为双硫死亡。当细胞发生双硫死亡时，细胞内二硫化物分子的过度积累在肌动蛋白细胞骨架蛋白中诱导二硫化物应激，这使得肌动蛋白丝内二硫键水平增加，进而导致细胞骨架结构被破坏，最终导致细胞死亡。

血管内皮细胞是具有促进凝血维持血管通透性等作用的血管屏障[6]，当脓毒症发生时，内皮细胞出现大量损伤、死亡使得血管通透性增高，引起微循环灌注不足，进而导致毛细血管通透性增加，造成组织器官损伤，因此血管内皮细胞被认为是脓毒症的重要病理靶点[6-7]。血管内皮细胞通过各种连接分子连接到肌动蛋白细胞骨架上从而形成一个完整的结构，因此，肌动蛋白细胞骨架在调节内皮细胞接触的稳定性和血管通透性方面起着重要的作用[8-9]。当细胞出现双硫死亡时，由于胞内二硫键的积累诱导双硫应激和细胞毒性，肌动蛋白细胞骨架也会遭到破坏[5]。因此，脓毒症患者体内可能存在双硫死亡，且双硫死亡可能密切参与脓毒症中微循环紊乱的病理过程，是今后研究的重点。

然而，目前在脓毒症的诊断和治疗中，尚未有与双硫死亡相关的生物机制研究。此次研究在脓毒症患者和健康对照者之间筛选出了差异表达的双硫死亡关键基因。为了预测双硫死亡关键基因在脓毒症中的潜在诊断价值，此次研究首次构建了风险预测模型并使用外部数据集进行了验证；随后通过共识聚类算法将脓毒症患者分为2种不同亚型，并比较了二者间的差异，为脓毒症的诊断和个体化治疗提供有效的分子靶点。

1、资料与方法

1.1数据检索与数据下载：

本研究以“sepsis”为关键词，通过GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）进行搜索微阵列数据集，文章下载了2个脓毒症血清数据集，即GSE69528以及以GSE541542作为本次研究训练组，以作为本次研究验证组。双硫死亡相关基因从2023年2月至2023年11月4日已发表的文献中获得。

1.2差异表达双硫死亡基因的获取：

采用“limma”包筛选GSE69528中54例脓毒症患者和28例健康对照患者中的差异表达双硫死亡基因，纳入标准P<0.05。使用“ggplot2”和“pheatmap”包绘制箱线图与热图来描述脓毒症患者与健康对照者之间双硫死亡差异基因的表达。

1.3基于9种机器学习方法的预测模型构建：

机器学习预测模型包括支持向量机（SVM）模型、随机森林（RF）模型、广义线性模型（GLM）、极限梯度提升模型（XGB）、梯度提升机模型（GBM）、广义线性模型（GLM）、K-近邻模型（KNN）、人工神经网络模型（NNET）、Lasso算法模型（LASSO）、决策树模型（DT）。使用“DALEX”软件包对九个机器学习模型进行了解释，并可视化了模型之间的残差分布和特征重要性。ROC曲线的AUC使用“pROC”R软件包进行可视化。最终，我们确定了最优的机器学习模型，并选择前3个基因作为脓毒症相关的关键预测因素。

1.4构建列线图模型预测脓毒症患病率：

利用“rms”包基于机器学习筛选的3个双硫死亡关键基因，构建了列线图模型。根据列线图模型中各个影响因素对结局变量的影响程度的高低，给每个影响因素的每个取值水平进行赋分，然后再将各个评分相加得到总评分，最后通过总评分与结局事件发生概率之间的函数转换关系，从而计算出该个体结局事件的预测概率。为了验证该模型的准确性，研究还绘制了“校准曲线”以及“决策分析曲线”用于评估预测值与实际值的一致性。

1.5基于脓毒症关键基因的共识聚类分析及不同亚型间差异基因的获取：

使用“Consensus Cluster Plus”R语言程序包对筛选出的3个双硫死亡在脓毒症患者的表达进行亚组分析，探讨双硫死亡关键基因在脓毒症中的作用。不同亚组间的差异表达基因使用“limma”R语言程序包鉴定，差异倍数为1，调整后P<0.05。

1.6主要观察指标：

(1)双硫死亡基因的差异分析；(2)机器学习模型的构建与选择；(3)列线图模型的构建与验证；(4)共识聚类分析；(5)免疫浸润分析。

1.7统计学分析：

所有参数分析都基于双侧检验，Kruskal-Wallis检验用于比较组间的差异，采用线性回归分析探讨关键基因与差异表达的免疫细胞之间的相关性。t检验分析方法筛选出与绝经后脓毒症密切相关的双硫死亡特征基因，P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1脓毒症相关双硫死亡基因的差异分析：

为分析双硫死亡基因在脓毒症患者和非脓毒症患者之间的表达差异，课题组利用t检验分析方法一共筛选出11个与脓毒症密切相关的双硫死亡特征基因，与健康对照组相比RAC1、ACTB、NDUFA11、LRPPRC、MYL6、TRIP6、MYH9、SLC3A2、IQGAP1在脓毒症中呈现过表达，NUBPL、OXSM在脓毒症中低表达，见图1。

图1|脓毒症中双硫死亡关键基因

图注：图A为脓毒症组和健康对照组中双硫死亡关键基因的差异表达箱线图，AP<0.001,BP<0.01,CP<0.05；图B为P<0.05的差异表双硫死亡关键基因在脓毒症组和健康对照组的差异表达热图

2.2模型的构建与选择：

从11个双硫死亡差异基因中构建了支持向量机（SVM）模型、随机森林（RF）模型、广义线性模型（GLM）、极限梯度提升模型（XGB）、梯度提升机模型（GBM）、广义线性模型（GLM）、K-近邻模型（KNN）、人工神经网络模型（NNET）、Lasso算法模型（LASSO）、决策树模型（DT）共9种机器学习模型用于预测脓毒症疾病的发生。研究显示：“残差箱线图”（图2A）表明KNN模型的残差最小，说明选择KNN用于预测脓毒症疾病的发生更有意义。此外ROC曲线（图2B）的AUC值也同样表明KNN模型、SVM模型、LASSO模型比其余6种机器学习模型具有更高的准确性（AUC=1.0）。因此综合来看，KNN模型在此次构建的机器学习模型中预测准确性更高，因此选其作为本研究的预测模型。绘制特征基因的重要性评分图（图2C）评分的高低决定基因的重要性，选择评分排名前三的特征基因用于后续的分析。绘制3个特征基因作为单基因预测疾病模型准确性的ROC图（图2D），结果显示单个基因作为脓毒症发病预测模型时AUC值均大于0.85，准确性较高，但并不优于3个基因结合构建的疾病预测模型。故本研究选择3个基因联合构建预测模型进行后续研究。

图2机器学习模型的构建

图注：图A为9种机器学习模型各自的残差箱线图；图B每种机器学习预测模型受试者工作特征曲线和曲线下面积值；图C为双硫死亡重要性评分图；图D为3个关键基因（ACTB、TRIP6、MYL6）作为单基因构建预测模型时各自的工作特征曲线和曲线下面积值

2.3列线图模型的构建与验证：

基于上一步获得的双硫死亡关键基因（ACTB、MYL6、TRIP6），构建了列线图模型（图3A），总和双硫死亡关键基因的评分，并根据评分预测脓毒症发病率。决策分析曲线图显示列线图模型的净受益率高于单个双硫死亡特征基因（图3B）。校准曲线发现，列线图模型能够较准确地预测脓毒症的阳性率（图3C）。最后使用外部数GSE95233进行验证，外部数据校准曲线表明该预测模型具有一定的预测能力（图3D）。

2.4共识聚类分析鉴定脓毒症亚型：

基于3个双硫死亡关键基因，通过共识聚类分析方法确定了2种不同的脓毒症亚型（簇C1和簇C2），见图4A。主成分分析表明基于3个双硫死亡关键基因可以有效区分2种脓毒症亚型（图4B）。热图和箱线图显示了双硫死亡关键基因在2种亚型之间的差异表达水平（图4C,D），可见MYL6、TRIP6在簇C2中的表达量高于簇C1；而ACTB在两亚型中不具有统计学意义。

2.5免疫浸润分析：

ssGSEA结果（图5A）显示，C2型患者主要在B细胞、伽马/德尔塔T细胞、巨噬细胞、Th1辅助细胞中呈高表达状态。研究还对3个双硫死亡关键基因与各种免疫细胞之间的相关性进行了评估（图5B），结果显示TRIP6与多种免疫细胞正相关性强。随后绘制了脓毒症患者中TRIP6在不同免疫细胞之间的差异箱线图（图5C），结果表明TRIP6呈高表达的脓毒症患者免疫功能较强。

图3列线图模型的构建与验证

图注：图A示基于双硫死亡关键基因的列线图模型构建；图B为决策分析曲线图；图C为本研究列线图模型的校正曲线；图D为外部数据集（GSE95233）校正曲线

3、讨论

脓毒症作为一种世界范围内危害较大的疾病，已经取得广泛研究并取得了一定的进展，但是由于该疾病的发病机制尚未完全明确，目前的治疗效果仍然不令人满意，临床死亡率仍较高。因此确定更有效的诊断标志物及治疗靶点以指导脓毒症的个体化治疗至关重要。双硫死亡是最近报道的一种新型细胞死亡，主要由二硫键的积累引起，导致细胞骨架坍塌和随后的细胞死亡，这与疾病进展密切相关[3]。然而，双硫死亡在各种疾病中的具体机制及其潜在途径尚未得到进一步研究。因而，本研究试图阐明双硫死亡相关基因在脓毒症中的作用，将双硫死亡与脓毒症的发病机制联系起来，并通过生物信息学分析鉴定潜在的关键基因，以探索潜在的治疗靶点。

此次研究利用GEO数据库探讨了双硫死亡基因在脓毒症患者中的相关作用，通过对脓毒症患者和健康受试者外周血样本之间进行差异表达分析，建立了9种机器学习预测模型，并最终选择K近邻模型作为最合适的训练模型。基于此，此文构建了能够预测脓毒症患病风险的列线图模型并进行验证，同时决策分析曲线和临床影响曲线分析显示该列线图模型对临床诊断具有一定参考意义，因此最终确定了3个与脓毒症相关的诊断性双硫死亡关键基因（ACTB、MYL6、TRIP6）。随后基于双硫死亡关键基因，此文将脓毒症患者划分为2种不同的亚型（簇C1和簇C2），并根据2种亚型间的差异基因进一步将脓毒症患者分为2种不同的双硫死亡基因分型（基因簇A和基因簇B）。最后计算了在脓毒症中不同双硫死亡模式和双硫死亡基因模式之间相应的双硫死亡分数，结果表明双硫死亡在簇C2和基因簇B中相关性更高。此外，在不同亚型免疫浸润分析中，簇B和基因簇B在多种免疫细胞中呈高表达状态，表明机体可能处于炎症微环境中。这提示经预测模型鉴定为簇B的脓毒症患者可能具有更加明显的病理改变，应尽早予以关注。

图4 3个双硫死亡特征基因的共识聚类分析

图注：图A为两种不同的脓毒症亚型；图B为PCA分析，显示不同模式之间基因存在显著差异；C为两个族群中3个双硫死亡特征基因的共识聚类箱线图；D为两个族群中3个双硫死亡特征基因的共识聚类热图，AP<0.001,CP<0.05

ACTB是一种重要的细胞骨架蛋白，在细胞分裂、迁移、侵袭、囊泡运输和细胞结构调节中发挥重要作用[5]。ACTB可以激发一氧化氮合酶活性，增加血液中一氧化氮含量，过量的一氧化氮堆积可导致血管内皮细胞死亡使得血管屏障作用减弱或消失，最后导致机体的微循环障碍[6-7]。既往的众多研究也表明，患者体内异常累积的一氧化氮是脓毒症微循环障碍发生的重要病理基础[8-10]。Wang等人[11]发现在冠状动脉疾病样本的心外膜脂肪组织中，ACTB的表达显著增加，这说明ACTB可能通过调控机体产生额外的一氧化氮以损伤内皮细胞来作为冠心病重要的发病因素。另一项国内的研究也证实了ACTB与冠心病的发病密切相关[12]。因此本研究推测当脓毒症发生时，人体内ACTB出现过表达，此时微血管内皮细胞因过度堆积的一氧化氮而出现死亡，进而导致血管屏障作用减弱而后带来机体的微循环障碍。

图5脓毒症亚型间的免疫浸润分析

图注：图A为单样本基因组富集分析（ssGSEA）；图B为双硫死亡关键基因与免疫细胞的相关性分析；C为脓毒症患者TRIP6在不同免疫细胞之间的差异箱线图。BP<0.01,CP<0.05

MYL6是肌球蛋白轻链家族的一员，其参与包括肌肉收缩、胞质分裂、细胞内运输、信号转导和细胞运动等人体生理功能[13]，其是双硫死亡复合体的重要组成部分，被认为在双硫死亡中起主要作用[3]。虽然目前MYL6与脓毒症的关系尚未得到佐证，但本次构建的9种机器学习模型结果均有MYL6，这或许提示其是脓毒症相关双硫死亡机制其中关键的基因，其可能将成为脓毒症新的诊断及治疗靶点，具有较大的研究价值。

TRIP6是LIM蛋白中zyxin家族的一种适配蛋白，其参与多种细胞反应，如肌动蛋白细胞骨架重组、细胞黏附和迁移、抗凋亡信号等，因其可以调节多种信号通路，且在不同的细胞反应中发挥多种功能，因此可能成为各类疾病诊断和治疗的靶点[14-15]。有研究表明TRIP6可以增强RIP2介导的NF-kB通路活化，亦可参与TNF等细胞因子诱导的NF-kB通路的激活。NF-kB通路是免疫、炎症反应、细胞死亡的相关通路之一，当脓毒症发生时，NF-kB通路被充分激活，此时NF-κB二聚体向细胞核转移，并与靶基因结合，促进炎症因子的大量释放，而炎症因子的释放再次促进NF-kB通路进一步激活，如此恶性循环得以形成，并加剧了炎症风暴造成脓毒症患者多器官障碍[16]。而相关研究也证明通过靶向抑制NF-kB通路活化可以抑制脓毒症相关炎症反应并减轻多器官功能损害[17-20]。因此本研究推测当脓毒症发生时，TRIP6可通过激活NF-kB通路加重患者体内的炎症反应，导致患者多脏器衰竭，进而加剧脓毒症发展进程，而靶向抑制TRIP6过表达可能可以通过缓解机体炎症反应从而达到治疗脓毒症的目的。

综上所述，基于3个双硫死亡关键基因，本研究首次建立了脓毒症预测模型，可以较好地预测脓毒症的发病风险；首次发现脓毒症患者可分型为两种完全不同的双硫死亡分子亚型（簇C1和簇C2），簇C2患者免疫功能更强。研究的分析结果对于后续双硫死亡在脓毒症的基础研究具有一定的参考价值。不置可否，这项研究仍有一定的局限性，首先，应收集更多的脓毒症患者的临床表征信息，如年龄、基础病情况、营养状况、临床评分、辅助检查指标等，以进一步分析，此外需要深层次的基础研究及临床研究以明确双硫死亡在脓毒症中的作用机制。

参考文献:

[23]缪莎莎,杨小平,彭鹏.核因子κB信号通路在脓毒症中对多器官功能障碍影响的研究进展[J].中国医药,2023,18(05):793-6.

文章来源:陆冠宇,刘志兵,兰韦幸,等.双硫死亡因子在脓毒症中的诊断标记物及亚型分析[J].哈尔滨医药,2024,44(04):56-62.