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优化围术期管理制作盲肠穿孔法小鼠脓毒症模型

2024-08-07 142 上传者：管理员

摘要：目的通过模拟贴近临床围术期的护理技巧、管理经验和注意事项，建立标准化和规范化的小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症动物模型术后管理模式，评价其对于模型建立的影响。方法将BALB/C雄性小鼠随机分为对照组和实验组，每组15只，制作CLP模型（盲肠结扎长度1 cm,12 G针头贯穿2孔）。术前2组小鼠给予常规喂养，实验组小鼠术后采用保温、补液、伤口护理等方式处理；对照组小鼠术后不作处理。记录2组小鼠术后7 d的体质量、采食量、动物状态、存活率。结果实验组小鼠建模后在体质量恢复、采食量和动物状态方面均明显优于对照组（P<0.05）；同时实验组小鼠术后7 d存活率为80.0%，显著高于对照组的53.3%(P<0.05)。结论将围术期管理经验用于小鼠脓毒症模型的建立，有助于提升动物实验的质量和效率，可避免因术后意外事件导致模型动物的非计划死亡，干扰对结果的判断，同时也更为贴近临床脓毒症患者的治疗管理措施，为标准化脓毒症动物模型的建立与应用提供借鉴。

关键词：
CLP模型
围术期
并发症
术后管理
脓毒症
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脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、外科手术后等常见的并发症，可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，目前尚无特效治疗药物[1]。因此，研究其发生机制和有效治疗措施具有重要意义。脓毒症患者早期以创伤或感染引发的休克反应为主，随后进入炎症与免疫抑制共存的复杂病理生理状态。目前临床采用保温、液体复苏、升压药物等早期集束治疗措施，能够有效纠正休克，提高脓毒症患者的早期存活率，但对于随后出现的炎症风暴和免疫抑制所造成的多系统、多脏器功能障碍尚未取得进展。研究休克救治成功后的系列问题及其对策，仍是脓毒症研究领域的重点和难点问题。

动物模型是医学研究的基本手段之一，对实验动物建模后的正确管理，是保证模型稳定性和贴近临床病情的有效保证。目前已有多种动物模型用于脓毒症的研究，常用的模型主要包括内毒素激发模型、活体生物腹腔注射模型以及通过盲肠结扎和穿刺诱导实验性微生物腹膜炎模型。盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）模型已被证明与人类临床脓毒症的性质和发病过程非常相似[2-4]。CLP模型属于手术创伤感染模型，通过结扎盲肠造成局部组织坏死，并通过盲肠穿孔导致内容物外流引发感染，相对于注射模型而言，该模型还涉及围术期的管理、术后感染和并发症的及时观测与控制等，影响因素较为复杂，需要进行规范操作以减少非预期因素对模型的影响[5]。然而目前国内外相关研究主要集中在盲肠结扎和穿刺的标准化操作，而对CLP模型围术期的管理以及术后的护理关注不足，可能影响模型稳定性。此外，采用早期保温和液体复苏等手段也可能让模型动物度过休克期，进而体现出炎症与免疫抑制的相关表型，有利于模拟与临床更为贴近的脓毒症病情。

脓毒症为重症患者的致死性并发症，故造模所致的动物死亡率和死亡时间是评价模型构建成功的核心指标[6]。为此，本实验选用小鼠盲肠结扎穿刺建立脓毒症模型，在建模过程中引入基于临床围术期的护理技巧、管理经验和注意事项的操作规范，同时给予保温和液体复苏，重点关注上述措施对模型小鼠死亡率和死亡时间等的影响。以期探索提高模型可靠性和稳定性的有效路径，为开展脓毒症的机制研究、药物研发、临床治疗提供可靠、规范的操作方法，也为落实动物福利要求、建立标准化动物模型提供有益的参考和借鉴。

1、材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

乳酸钠林格氏液、75%乙醇、碘伏棉球、眼科剪、眼科镊、持针钳、缝合针（△1/2 SX12）、2-0缝合线、1 mL一次性注射器、保温箱、保温垫、异氟烷、小动物麻醉机、电子天平、电动剃毛刀。

1.2 实验对象

BALB/c雄性SPF级小鼠30只，体质量19～22 g，术前毛色光亮、皮色红润无缺损、反应机敏精神好、四肢有力、大小便正常，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0008]，于陆军军医大学第一附属医院实验动物中心完成实验[动物使用许可证号：SYXK(渝)2022-0009]，饲养环境为万级小鼠饲养区，温度23～25℃，湿度55%～65%，饲料为无菌实验鼠维持饲料，饮水为纯净水。实验过程中严格遵守实验动物福利伦理相关要求。

1.3 模型制备

术前异氟烷吸入麻醉，小鼠仰卧位固定，腹部备皮，碘伏消毒；在剑突下1.5 cm处沿腹中线做长约1 cm的纵切口，剪开腹膜暴露腹腔，用眼科镊从腹腔拉出盲肠末端；用2-0缝合线于盲端1 cm处结扎，注意避免损伤肠系膜血管，结扎后用12号针垂直穿透盲肠2孔，将肠管还纳腹腔；逐层缝合关腹，消毒切口，见图1。

1.4 分组及术后处理

小鼠适应性饲养1周。模型制作前随机分为对照组和实验组，每组15只，术前禁食12 h，不禁水。对照组小鼠麻醉后，于室温（23～24℃）完成手术，术后直接转入小鼠笼盒饲养，不作处理。实验组小鼠麻醉后，手术在保温垫上完成；术后颈部皮下注射乳酸钠林格氏液补液（1 mL/20 g，连续3 d，每天1次），随即转入保暖箱（温度为30℃，保温72 h），小鼠苏醒前侧卧姿势，脖子伸直，保持呼吸通畅，观察小鼠的呼吸频率和心率，直至动物完全苏醒。术后每天检查伤口情况，并用碘伏消毒1次。术后3 d拆线并消毒伤口。

图1 模型制备

1.5 观测指标

观测记录2组小鼠的存活率、采食量、体质量和动物状态。计算2组小鼠术前及术后1～7 d的平均采食量。术前称量小鼠体质量，术后1～7 d，每天称量1次。动物状态评价指标[7]：有无竖毛脱毛、口腔有无流涎、肛门处有无腹泻或血便；自主活动频率；有无震颤痉挛；呼吸频率和深浅有无异常；精神是否活泼，对外界反应是否正常；立、卧、坐的姿势有无异常，步态状况。每项1～5分，总分30分，评分越高，动物状态越好。

1.6 统计学分析

实验数据采用SPSS 13.0软件进行分析，不同样本采用单因素方差分析进行比较，P<0.05表示差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 6作图。

2、结果

2.1 存活率

对照组和实验组建模后7 d的存活率分别为53.3%、80.0%,2组比较差异有统计学意义（P<0.01），见图2a。

2.2 采食量

术后2组小鼠采食量均显著减少后逐渐增加（P<0.05），实验组小鼠术后2～4 d的采食量恢复情况优于对照组（P<0.05），见图2b。

2.3 体质量

术后2组小鼠体质量均显著降低（P<0.05），术后1～6 d对照组小鼠体质量低于实验组（P<0.05），术后第6天开始趋于平稳上升，见图2c。

2.4 动物状态评分

术后2组小鼠动物状态评分均显著降低后逐渐升高（P<0.05），术后第7天接近于术前状态；实验组小鼠术后1～4 d动物状态评分优于对照组（P<0.05），见图2d。

图2 2组小鼠存活率、采食量、体质量和动物状态评分比较

3、讨论

脓毒症发病机制复杂，表现形式多样。在动物模型中以存活率降低、体质量明显下降和动物状态差等脓毒症典型病理生理改变为主要外在体征指标[8]。

本研究通过借鉴临床围术期护理经验，结合脓毒症患者的治疗原则，采用术后加强观察和伤口护理结合保温、补液等综合措施，建立了标准化的CLP模型小鼠术后管理操作规范，一方面减少模型动物非计划死亡，确保了操作的稳定性；另一方面也让模型小鼠能够顺利度过早期休克期，避免了早期死亡，更有利于模拟贴近临床实际的脓毒症模型的观察、干预和指标检测[9-11]。经多次实验结果证实，围术期的这些措施具有良好的可操作性，同时实验组小鼠的死亡率在50%左右，且死亡时间均发生在术后7 d内，与文献报道较为一致[12]，符合重症脓毒症的死亡率要求。为进一步评价模型小鼠建模成功的外在表型，本研究还观测了小鼠术后体质量、采食量、动物状态等指标的变化规律，结果显示，实验组小鼠以上指标在建模后均持续下降，其中采食量和动物状态在术后第1天后逐步恢复，体质量则因创伤后高代谢消耗，直至第6天后才止降回升。基于上述指标的变化规律，对比相关研究结果，我们认为本研究中脓毒症模型的建立是成功和可靠的。值得关注的是，给予围术期管理以及联用保温、液体复苏等措施的实验组小鼠，其死亡率显著低于对照组，且死亡时间明显后延，实验组小鼠中其他反映模型构建成功的指标，如体质量、采食量和动物状态等，也均优于对照组。上述结果均表明，围术期的管理有利于减轻手术直接造成的伤害，同时也可能减少脓毒症模型早期的休克死亡。此外，上述措施有利于模型小鼠度过早期休克期后，逐步发展为炎症、免疫抑制等更加贴近临床的病理生理特征[13-14]。基于此理念制作的脓毒症模型和建模措施，也更加符合临床脓毒症患者的病程规律和治疗模式。

综上所述，小鼠CLP模型的围术期管理涉及术前准备、术中实施和术后护理各个细节。本研究通过模拟临床围术期的护理技巧与管理经验，综合考虑动物模型的选择和建模等研究背景、研究对象以及管理情况，包括术前准备、术中管理、术中护理等多环节情况[15]，在设计动物实验的手术方案时要求所有实验参与人员对实验步骤熟练掌握，并进行预实验摸索，同时在处理实验问题的过程中及时总结经验教训，不断提高对实验动物围术期的护理水平，保证其生活质量和动物福利，提升动物实验的质量和效率。

参考文献:

[3]解娇,李锦平,张伟.基于加速康复外科理念的围手术期护理对重型颅脑损伤患者术后恢复的影响[J].临床与病理杂志,2023,43(4):810-818.

[4]蔡莉芳,潘学康,陈颖.基于量化评估策略的围手术期护理在腰椎滑脱症患者手术中的应用研究[J].中国现代医生,2023,61(20):96-100.

[5]马晓杰,姚波暖,游咏,等.肾移植围手术期康复治疗研究进展[J].器官移植,2023,14(3):466-472.

[7]范仕郡,吴丹,夏林,等.小鼠烧伤创面脓毒症模型的建立与评价[J].中国比较医学杂志,2022,32(6):7-13.

[8]文康,姚一帆,吴春艳,等. C57bl/6n小鼠CLP模型的建立和评价[J].河南大学学报(医学版),2022,41(3):175-179.

[9]郭振华,李力,刘巨超,等.一种改良小鼠脓毒症模型的建立[J].中华实验外科杂志,2008,25(4):510-512.

[11]荆喜中,贾欢欢,罗挺,等.小鼠脓毒症模型的建立和评价[J].中国实验动物学报,2016,24(2):158-163.

文章来源:郭艳,胡小芳.优化围术期管理制作盲肠穿孔法小鼠脓毒症模型[J].局解手术学杂志,2024,33(08):740-743.