转基因植物,指利用基因工程和遗传工程技术将优良性状功能基因整合进入目标植物的基因组的一定位置,并得以表达,从而获得的具有新的遗传性状的植物[1]。复合性状转基因植物是把2个或多个外源基因(能表达相应性状)利用基因工程技术或杂交育种技术整合到同一植物的基因组中,使植物能够表达出,并在后代可稳定遗传的新特性[2],而转化到植物中的2个或2个以上的有效目的转基因统称为复合转基因性状[3]。

当今世界,全球饲料、粮食、燃料和纤维需求不断增加,迫切需要不断出现农业创新来推动全球生产力和可持续性发展,因此,需要持续开发转基因作物以提高作物产量[4]。自1983年第一例转基因植物被培育出来,转基因植物的研究进展迅猛,相继培育了抗虫、除草剂、抗病、食用疫苗生产等特色多样化的的转基因植物[5,6]。但由于转基因生物技术可以把几乎所有生物物种甚至利用人工手段合成的基因整合进目标植物,这种情形在自然界多是不容易发生的,人们不能预测将未知基因转入一个全新的遗传背景中导致的后果[7],部分人群对转基因植物和转基因食品的安全性存有疑虑。该研究简要综述了转基因植物的研究现状、转基因植物的安全性及其评价的研究进展,以期为我国的转基因植物及其安全性的研究提供参考依据。

1、转基因植物研究现状

1.1常用的植物转基因技术方法

转基因生物技术是指将某一生物物种基因组导入外源基因并使其有效地表达相应产物的技术。众所周知,传统育种方法主要有品种间杂交、远缘杂交、辐射诱变、体细胞变异等[8]。转基因技术育种使受体植物获得新的特定的性状[8],实现了蛋白序列、基因序列、功能位点、插入位点的精准[9],促进了基因交流、创造了新的遗传变异[8]。目前,基因枪介导法和农杆菌介导法是主要的将外源目的基因转入植物的方法[10]。全球大面积推广的转基因植物,诸如玉米、大豆、油菜、棉花和木瓜大多是借助农杆菌转化技术获得的产品[10]。

1.2基于CRISPR的基因编辑技术

CRISPR是一种功能强大的、新的基因组编辑技术[11],具有编辑效率高、操作过程简便、实现多靶点编辑、形式多样等特点[12]。CRISPR/Cas系统首先发现于细菌和古细菌中,作为一种基因编辑技术,在2013年被开发利用[13]。CRISPR/Cas9系统使用单引导RNA开展基因组编辑,使其成为针对敲除和敲入/替换、靶基因突变、以及转录调控的强大而简单的工具[14]。gRNA通过和靶序列的碱基配对结合到DNA上,同时gRNA可以招募Cas9蛋白。Cas9蛋白与gRNA结合并识别靶序列下游的PAM位点,在PAM上游约3bp处切割DNA双链,形成DNA双链断裂[15],继而由细胞自身的同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)自然修复机制引发生物体内源性的DSB修复。NHEJ修复是产生随机插入和缺失,并导致框移位突变和靶向基因敲除,而HR通路在同源序列交换中更精确,导致基因敲入或基因置换[15]。在DSB修复的过程中会在双链断裂的位置引起若干碱基的插入或者缺失,从而造成DNA靶位点基因编辑[16]。可以看出,利用CRISPR/Cas得到的转基因植物通过性状分离和进一步筛选可得到不含任何外源基因的突变体[17]。这种CRISPR/Cas先进育种方法产生的变异与自然发生的变异很难加以辨别[18]。CRISPR适用于真核基因编辑,可以在真核细胞的精确位置切割生物基因组DNA[19]。

CRISPR/Cas已应用于包括大豆[20]、模式植物和作物、真菌和细菌性疾病[21]、玉米和大豆耐旱性、籽油成分改善和赋予除草剂耐性等[18]。HDR是一种非常理想的DSB修复途径。HDR介导的修复系统能够定位拟南芥的基因,成功获得水稻双等位基因突变体,对番茄、玉米和大豆进行精确的遗传修饰[13]。LI等[22]用CRISPR/Cas9系统突变水稻Gn1a、DEP1、GS3和IPA1基因。结果表明,CRISPR/Cas9系统在诱导靶向基因编辑方面具有很高的效率,所需基因在转化植物中的编辑率分别为42.5%(Gn1a)、67.5%(DEP1)、57.5%(GS3)和27.5%(IPA1)[22]。结果也证明,一个品种可以通过CRISPR/Cas9对多个重要性状的调控因子进行修饰,从而有利于同一基因组背景下复杂基因调控网络的剖析和栽培品种重要性状的叠加[22]。LIANG等[23]用CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNPS)对面包小麦进行基因组编辑,成功获得突变体。由于在CRISPR/Cas9RNP介导的基因修饰中没有使用外来DNA,因此,获得的突变体完全不含转基因[23]。禹明森等[24]以生菜子叶作为外植体,通过农杆菌侵染成功建立了生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系。

此外,CRISPR/Cas9可以通过DNA甲基化或组蛋白修饰进行表观基因组编辑方面的应用。尽管CRISPR/Cas9可以应用于植物基因组编辑,但仍然存在着一些挑战,如尽量减少脱靶率以及如何优化Cas9功能[13]。

CRISPR通过2类RNA引导的核酸酶效应器介导对外源遗传因素的防御。1类效应器利用多蛋白复合物,而2类效应器依赖单组分效应器蛋白,如Cas9[25]。ZETSCHE等[25]鉴定了另一个2类CRISPR效应器,Cpf1(CRISPRfromPrevotellaandFrancisella1),拓宽了基因组编辑的视野,Cpf1是一种与CRISPR相关的双组分RNA可编程DNA核酸酶,介导具有不同于Cas9特征的强大DNA干扰。在CRISPR-Cpf1系统中,相邻motif(PAM)的T-richPAM在识别位点的远端区域产生双链断裂(DSBs),产生粘合端。而在CRISPR-Cas9系统中,一个G-richPAM朝着识别站点的近端创建DSB,导致钝端[15]。由于Cpf1小于Cas9,因此,更容易被装入到运载工具中,具有针对不同基因序列的潜力,这种碱基编辑技术克服了NHEJ和HR方法的一些局限性,并且在不需要DSB或供体模板的情况下实现目标碱基转换。而利用CRISPR/Cpf1碱基编辑技术已经在水稻植株中引入点突变,以改善营养、抗除草剂、提高氮素利用效率、调节细胞衰老和死亡[15]。

在中国,爆发了CRISPR革命。在最近一项对2000多项涉及CRISPR的独特发明专利申请的分析中,专利涵盖技术改进、医药应用、农业应用、工业应用及其他领域,中国几乎超过美国。PubMed数据显示,2012—2018年,中国公开发表与CRISPR相关的论文2059篇。2018年,中国的CRISPR相关专利、论文分别以858项和824篇位列全球第二[26]。

GAO等[27]的研究表明,用NgAgo(NatronobacteriumgregoryiArgonaute)可以实现DNA引导的基因编辑。尽管作者在2017年8月撤稿,但也确实引起科学界的争论。随后,FU等[28]报道NgAgo以80%～100%的效率增强了巴氏杆菌和大肠杆菌的基因插入或缺失。NgAgo系统的基本机制是一个正向选择过程,主要通过其PIWI样结构域与重组酶A(recA)相互作用来增强recA介导的DNA链交换[28]。对于大多数科学界来说,确定NgAgo是否会在与CRISPR/Cas9的竞争中胜出并不重要,反之亦然。科研工作者愿意看到在基因组工程工具包中出现另一个令人感兴趣的基因编辑工具[29]。

1.3国内外转基因植物种植现状

基因工程作物按特性一般被分为3代。具有增强的输入特征,如抗杀虫剂或除草剂或抵抗昆虫和抗环境压力(如干旱)[30,31],植物成分没有实质性改变,为第1代。第2代转基因的特点是具有增值的输出特性,增加所需要的物质含量,或者降低不符合需求的物质含量[30,31]。第3代转基因作物包括允许生产传统食品和纤维以外的药品和产品的特性[31]。目前,有70个国家或地区为生物技术/转基因作物颁发了4349项监管批文,涉及387个生物技术转化体,其中2063项涉及粮食、1461项事关饲料、825项有利于环境释放或进行耕种。

1.3.1国外转基因植物种植现状

美国自1996年开始第一例转基因作物的商业化种植[31]。2015年,美国种植了7090万hm2转基因作物[11]。尽管研究和开发的速度(以美国农业部批准的田间试验的数量衡量)在2002年达到顶峰,但生物技术公司继续快速开发新的转基因种子品种[31]。

在全球范围内,大规模商业化种植的转基因植物主要涉及4种作物(大豆、玉米、棉花和油菜)和2个转基因性状(抗虫和耐除草剂)[32]。亚太地区仍以种植非人类直接食用的转基因棉花为主。已上市品种有甜菜、木瓜、茄子、马铃薯和苹果[33]。1996年全球总种植面积仅为170万hm2[33]。随后,转基因作物种植面积逐年增加,2010、2014、2016年全球转基因作物种植面积分别增加到1.480亿hm2[34]、1.815亿hm2[33]、1.851亿hm2[9],共有26个国家与地区种植转基因植物,其中发达国家7个、发展中国家17个[9]。2017年,全球26个国家种植1.898亿hm2转基因作物,2018年,达到1.917亿hm2转基因作物。这种短短20年的100倍的增长使生物技术成为近年来采用最快的作物技术。而CRISPR在全球15亿hm2耕地上以“可持续强化”模式提高作物生产力,为全球粮食安全和人类做出了非常大的贡献[11]。

2018年,美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度成为全球五大转基因种植国,全球种植的转基因作物中,有50%的面积是转基因大豆。2018年,美国种植的转基因作物包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜、苜蓿、木瓜、南瓜、马铃薯、苹果,面积高达7500万hm2,居全球第1位。巴西和阿根廷分别以5130万hm2(大豆、玉米、棉花、甘蔗)和2390万hm2(大豆、玉米、棉花)居全球第2、3位。加拿大和印度则分别为1270万hm2(油菜、玉米、大豆、甜菜、苜蓿、马铃薯)和1160万hm2(棉花)居全球第4、5位。

复合转基因技术满足了不同转基因作物性状及功能需求,实现了种植农户多样化的个性需求[3]。美国农民继续以强劲的速度采用转基因种子,具有复合性状的种子品种以非常快的速度增长[31]。2014年,13个转基因作物种植国种植了2个或2个以上性状的转基因作物,其中10个为发展中国家[2]。2013、2014年,全球复合性状转基因作物种植面积分别为4.7×106hm2和5.1×106hm2。2016年全球种植面积达到7.54×107hm2[9]。2018年,复合性状转基因特性作物的种植面积增长了4%,占全球转基因作物种植面积的42%左右。

1.3.2国内转基因植物种植现状

2014年,我国的转基因农作物和林木有22种,转基因植物中转入的性状以抗除草剂为主,大约超过40%,其次为抗病毒、抗虫和抗逆性等性状。转基因烟草、南瓜、豌豆、花生等作物和蔬菜,转基因云杉、杨树等已经大面积种植。转基因棉花等已经大规模商品化生产,有12个抗虫棉品种通过审定[35]。尽管中国迟迟未批准新的转基因作物和性状,但2018年,中国种植的转基因棉花和木瓜面积仍达到290万hm2,居全球第7位。2018年,中国抗虫水稻获得新颁发的粮食/饲料和加工批文。

2、转基因植物的安全性及其评价

2.1转基因植物的安全性

1975年在美国加利福尼亚举行的Asilomar会议上第一次提出转基因生物的安全性,它标志着人类开始正式关注转基因生物的安全性问题[36]。国际上首次提出生物安全(biosafety)概念的则是在阿斯洛马会议后,美国国家卫生院发布的重组DNA研究规则[37]。这一规则的出台,确保了转基因研究在整个研发过程中的安全性。

2.1.1标记基因及其安全性

目前,在植物转化系统中应用较为广泛的标记基因主要是抗生素和除草剂抗性基因,常用的抗性基因包括nptII、hpt和bar基因等[38]。目前,提高转基因植物标记基因安全性技术及改良策略主要有以下几种[39],利用无争议的、有生物安全标记的基因[39];将转基因植物中选择标记基因记忆去除[39];使用基于叶绿体基因工程的无选择标记基因转化系统[38];防止外源基因飘移的花粉不育技术[40]和无籽或种子不育的技术[40];基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术,而CRISPR/Cas由于其操作简单,效率高,广泛应用于植物的基因突变和转录调控,被认为是植物生物学中一项革命性的技术[13]。

2.1.2基因飘移及其安全性

基因漂移,又叫基因流动。植物中的基因流动是指基因或遗传物质从一种植物转移到另一种植物[41]。花粉运动可能对高度异交物种的基因流动有更多的贡献。花粉介导的基因流(PMGF)从转基因HR作物向野生或杂草亲缘植物流动的潜力在环境风险评估中很重要。种子散布有可能对HR基因的运动产生比花粉流动更大的影响。人类活动、动物及环境等因素影响种子介导的除草剂抗性传播的潜在距离[42]。

作物对野生基因流动的生态后果可能有3个[43]。1)可能产生更具竞争力的杂草;2)改变野生植物种群的基因频率;3)降低天然食草动物的生存率和繁殖力。LEE等[11]对转基因玉米向鸭茅状磨擦禾基因流动潜力进行了评估,结果表明,在自然生境中,没有证据表明基因从玉米向鸭茅状磨擦禾流动[11]。MILLWOOD等[44]发现转基因花粉的运动和杂交率与距离呈负相关。尽管在温室条件下,转基因植物花粉介导的基因流动风险较低[41],但花粉介导的基因流(PMGF)从转基因油菜(GM)经风和昆虫可以传播到其野生亲缘植物[45]。DUNCAN等[46]对转基因玉米杂交种对墨西哥本地玉米品种的潜在影响进行了评估。

2.1.3对转基因植物安全性的思考

转基因植物作为一种较为先进的产物,对满足日益增长的社会需求以及因人口数量急剧增长而带来的食品需求极为重要,可以有效地缓解当前食品缺乏的局面,其自身的安全性,也具有较高程度的实现[47]。转基因技术育种方法只改变了植物的少数基因或性状,其它基因及其编码的蛋白质没有发生太多改变[8]。转基因技术育种与传统育种比,并没有特别的风险与增加风险的可能性[9],转基因植物大规模商业化至今,也未出现对人类与动物健康有负面影响的报告[9]。

尽管美国农民对玉米、大豆和棉花转基因品种的采用迅速增加,但关于它们对经济和环境的影响、杂草抗性的演变以及消费者接受度等问题仍然存在[31]。逄金辉等[48]对截止2016年美国WebofScience数据平台的全部转基因作物生物安全SCI论文检索,发现已经批准商业化生产的转基因植物经过了有史以来最为严格的安全检测与检验,建立了非常严格的监管技术;在所发表的全部9000多篇有关转基因生物安全性研究中,99%以上的研究证明转基因技术的安全性与传统非转基因作物相比并无显著差异;而所有认为转基因食品不安全的研究,多是存在错误的研究方法或者使用了不当的研究材料。目前,已经批准上市的转基因作物产品都是安全的[17]。

栽培甘薯基因组中存在2个不同的T-DNA区域(IbT-DNA1和IbT-DNA2)[49]。IbT-DNA1被发现含有4个与色氨酸-2-单加氧酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、C-蛋白(C-Prot)和农杆糖脂合酶(Acs)同源的开放阅读框(ORF)[49]。在所有291个栽培种中检测到IbT-DNA1[49]。因此,甘薯作为一种广泛和传统消费的粮食作物,其实是一种天然转基因作物,这可能会改变消费者对转基因粮食作物安全性的不信任态度[49]。

基因编辑技术不涉及到外源DNA序列的整合,基因编辑植株中不含体外转入的DNA序列,基因组编辑植株并非真正意义上的转基因植株,在本质上等同于传统育种方法获得的遗传变异,进一步培育的植物品种安全性是可靠的。因而,一些国家已出台政策,将不对利用基因组编辑技术获得的植物产品进行任何形式的安全性评价[10]。

2.2转基因植物的安全性评价

国际上对转基因植物及其产品的安全性评价主要涉及3个方面[50]。一是导入的外源基因及其产物对受体植物是否产生不利影响,使受体植物具有生物安全性风险;二是转基因植物的使用带来的直接或间接的生态影响,即生态环境安全性风险;三是以转基因植物为原料的产品(食品、饲料)的安全性,即毒理安全性风险。

1993年经济发展合作组织(OECD)提出了食品安全性分析的实质等同性原则,即生物技术产生的食品及食品成分是否与目前市场上销售的食品具有实质等同性[51],并得到WHO、FAO、CAC的认可[9]。关键成分分析、营养学评估、毒理学评估与致敏性评估、抗生素抗性等标记基因的安全性是转基因食品食用安全性评估的主要内容[9,51]。ANDERSON等[4]将DP202216玉米和饲料的标准营养和成分参数(例如干物质、纤维、矿物质、氨基酸、脂肪酸、维生素、抗营养素、次级代谢物)与非改性玉米(对照)进行了对比。结果显示,来自DP202216玉米的谷物和饲料的成分与来自非改良玉米的谷物和饲料相当。

中国政府在转基因植物的研究和栽培、转基因产品的生产和流通等方面实施了全世界最严格的监管,而且市场上投放的转基因食品已经经过了苛刻的检查,并没有安全风险[17]。现已建立起了较为完善的法规体系、管理体系与技术支撑体系[52]。我国对转基因植物的评估以产品为基础,即无论转化体是否相同,每个新品种都要重新评估与审批[9]。在我国,通过安全性评价检测而批准上市的转基因植物、作物及其产品都是安全的,足以让不同的消费者放心[32]。

3、展望

据预测到2025年,世界人口将超过80亿。2050年,世界人口将超过97亿。预计到2020年的全球大米消费量将达到4.9亿t左右,到2050年将达到6.5亿t左右[15]。创新育种技术可以提高农业生产效率,保障粮食安全。利用转基因生物技术能够对大多数作物进行有针对性的有效改良[53]。

转基因植物与非转基因植物在成分上无显著差异[17]。遗传转化技术、基因克隆技术、以及基因编辑技术等生物技术的不断进步会强化转基因植物食用安全性[9]。尽管目前转基因植物的安全性具有很大的争议,前景仍旧十分美好[35]。政府部门、学校应更多地宣传转基因植物的科学理论,正确引导舆论[17],争论不断,阻挡不住。可以通过建立完善而有效的的安全评估技术体系,将其风险性降到最低水平,人们应该批判性地看待效益而不是风险[35]。事实已经证明,转基因作物不仅在农业、社会、经济和环境方面均产生良好效益,而且改善了营养水平,提高了食品安全水平。

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基金:北京市科技计划资助项目(Z171100001517001);河北省社会科学基金资助项目(HB13JJ084);邯郸市科学技术研究与发展计划资助项目(1322101065);邯郸学院自然科学研究资助项目(2017101).