呼吸是整个生命过程中非常重要且不能持续中断的生理过程[1-4]。人体通过节律性呼吸来维持生命活动，而呼吸运动又受到复杂的呼吸中枢神经网络的调控[5-8]。故呼吸中枢神经网络中的任何区域受到抑制都很有可能引起吸气动力或气道排泄等方面能力的减弱，甚至出现呼吸衰竭[9-12]。为了全面了解呼吸中枢神经网络，课题组前期对脊髓呼吸运动神经元的形态学进行了研究，描绘了全脊髓呼吸相关核团的图谱，但缺乏对上游输入大脑区域呼吸相关核团分布的描述[13]。延髓的前包钦格复合体(preBötzinger complex, preBötC)被一致认为是吸气节律的起源部位[14],并通过兴奋脊髓运动神经元使膈肌及肋间肌等吸气肌群收缩，始动吸气以实现肺部通气[5-8];同时呼吸也受到脑干以上呼吸相关脑区(如下丘脑)的调控[4,15]。下丘脑参与调节各种自主脑功能，同时驱动整个呼吸网络[16-21]。而下丘脑室旁核(paraventricular hypothalamic nucleus, PVN)被称为“下丘脑中枢”,是一个发挥高度整合功能的核团[22]。早年有文献报道指出：PVN的神经元可以投射到脑干和脊髓的“经典”呼吸控制区域，包括延髓头端腹外侧(rostral ventrolateral medulla, RVLM)、脑桥呼吸组[如臂旁复合体、孤束核(nucleus tractus solitarii, NTS)和膈核]等[23-30]。同时PVN也接受来自一些脑区(如NTS、迷走神经背侧运动核、海马和弓状核等)的传入纤维[31-32]。近年来对PVN的研究大部分是针对心血管、代谢、应激、疼痛及压力调节等方面[33-36],而在呼吸相关方面的研究，如PVN在呼吸中枢神经网络中的作用以及对呼吸调控机制等方面的研究报道相对较少。因此，本研究进一步利用伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)逆行示踪技术，描述脊髓呼吸运动神经元的上游输入脑区呼吸相关核团的空间分布，验证PVN在呼吸中枢神经网络中的重要位置。同时利用Cre/loxP基因表达策略及不跨突触示踪技术，验证PVN-preBötC环路的存在以及二者之间的直接突触联系。为后续PVN对呼吸调控作用的研究提供解剖学基础。

1、材料与方法

1.1实验动物

本研究使用8周龄C57BL/6J雄性小鼠，体质量22～25 g,共计36只，均购自湖南斯莱克景达公司。3～5只小鼠同笼饲养，置于25℃的恒温环境中，暗/光周期为12 h。自由摄食和饮水。遵照动物伦理指南进行小鼠实验操作。所有动物实验经过陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会批准(AMUWEC20227002),并严格遵循《国际动物实验指南》。

1.2病毒示踪手术

1.2.1逆行示踪手术

20只小鼠用1%～2%的异氟烷持续吸入麻醉，将其仰卧固定在小鼠操作台上，打开加热垫，保持小鼠体温。用手术剪去除小鼠胸前的毛发，充分消毒其局部皮肤。然后沿前正中线剪开皮肤，用显微剪缓慢分离皮肤与皮下组织，用组织剪剪开腹部肌肉组织，轻移动肝脏，暴露膈肌，用有齿镊沿着肋骨提起膈肌，暴露右侧膈肌。用Hamilton注射器(Hamilton公司，瑞士)抽取2μL PRV-EGFP(p03001,≥2.00×109PFU/ mL,BrainVTA,武汉枢密公司)斜行插入膈肌中，避免穿透膈肌，停留2 min,等待肌肉适应后缓慢注射，注射完毕后等待3 min使病毒在膈肌内充分扩散后拔针。若有渗出，用棉球擦拭干净，并再次对手术区域消毒，缝合皮肤，放回鼠笼中饲养，密切关注小鼠情况，并保证充足粮水。

1.2.2不跨突触病毒示踪手术

小鼠用1%～2%的异氟烷持续吸入麻醉，并将其固定在脑立体定位仪(RWD生命科学有限公司，深圳)上，打开加热垫使小鼠体温维持在37℃左右。剔除小鼠头顶部毛发，对头部皮肤进行消毒后，沿正中线剪开头颅皮肤，棉签擦去小鼠骨膜，暴露骨性标志。前后、左右分别调平定位仪后，利用Cre/loxP基因表达策略，用固定好的玻璃电极定位目标脑区(n=8)PVN [前后，即前囟前或后(anteroposterior, AP):-0.80 mm,左后，即中缝左或右(mediolateral, ML):±0.19 mm,上下，即颅骨硬脑膜平面向下(dorsoventral, DV):-4.8 mm],并在双侧PVN微量注射Dio-EGFP(rAAV-EF1a-DIO-EGFP-WPRE-Hgh polyA,5.20×1012VG/mL,BrainVTA,武汉枢密公司)80～100 nL/边，注射完毕停留5 min,使病毒充分扩散后退针。在同一只小鼠双侧preBötC(AP:-6.80 mm, ML:±1.35 mm, DV:-4.9 mm)显微注射Retro-Cre(rAAV-hSyn-CRE-WPRE-Hgh polyA, 5.45×1012VG/mL,BrainVTA,武汉枢密公司)并混合少量霍乱毒素β亚基555(cholera toxinβ-subunit Alexa Fluor TM 555, CTB555,用于标记颜色)以5∶1的剂量比例，共计80～100 nL/边，注射完毕停留5 min后退针。另一批小鼠(n=8)在双侧PVN(AP:-0.80 mm, ML:±0.19 mm, DV:-4.8 mm)微量注射AAV2/9(rAAV-hSyn-EGFP-WPRE-Hgh polyA, 5.27×1012VG/mL,BrainVTA,武汉枢密公司)100 nL/边，注射完毕停留5 min后退针。然后缝合小鼠头皮伤口放回笼中继续饲养。待病毒感染4周后行组织学实验。

1.3组织学和免疫荧光检测

将膈肌注射PRV-EGFP病毒后2.5～3.0 d(n=6), 3.5～4.0 d(n=6)以及4.5～5.0 d(n=8)的小鼠以及行脑定位注射不跨突触病毒的上述2组小鼠，待病毒感染4周后，分别予以1%～2%异氟烷麻醉后，再予以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)和4%的多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)溶液进行心脏灌注。随后剥离脑组织置于4%PFA固定，12 h后置换为含有30%蔗糖的PBS液，进行脱水直至脑组织完全沉底。包埋和冷冻脑组织后，将其从嗅球端至脑干端以40μm的厚度连续冠状切片，收集切片，用含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)的封片液封片，待其自然干后，置于4℃保存。

1.4荧光显微镜拍片及绘制脊髓呼吸膈运动神经元上游输入核团

利用VS200及共聚焦显微镜拍片，将膈肌注射PRV-EGFP病毒后2.0～2.5 d, 3.5～4.0 d以及4.5～5.0 d后的小鼠脑片分别进行整理。根据被PRV-EGFP标记的阳性神经元，绘制脊髓呼吸膈运动神经元上游输入脑区神经元群(即全脑呼吸相关核团)分布图。

1.5 PRV-EGFP阳性神经元计数

在PRV-EGFP注射4.5～5.0 d的小鼠脑片中，根据小鼠脑图谱，选取PVN、preBötC、NTS等14个脑区的所有脑片，对被PRV-EGFP标记的阳性神经元进行人工计数。

1.6统计学分析

使用GraphPad Prism 9.5.1软件进行统计分析。多组数据之间比较采用单因素方差分析。符合正态分析数据以形式表示。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 PRV从外周到中枢的逆行示踪结果

为了追踪脊髓呼吸膈运动神经元上游脑区的呼吸相关核团。将PRV-EGFP病毒注入小鼠右侧膈肌，并在PRV注射后的不同时间段采集脑组织标本(图1A)。结果发现病毒感染2.5～3.0 d后，脑内仅在大脑皮层[主要是初级运动皮层(primary motor cortex, M1)区域]、PVN、preBötC、嘴端腹侧呼吸组(rostral ventral respiratory group, rVRG)以及网状核(gigantocellular reticular nucleus, Gi)等区域发现少量PRV-EGFP阳性神经元。PRV-EGFP注射3.5～4.0 d后，在大脑皮层(主要是M1区域)、PVN、蓝斑(locus coeruleus, LC)、中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)、Gi、preBötC、rVRG、NTS等区域均发现PRV-EGFP阳性神经元。PRV-EGFP注射4.5～5.0 d后，在与3.5～4.0 d的相同区域，发现了更多的PRV-EGFP阳性神经元(图1B)。同时病毒注射4.5～5.0 d后，大多数小鼠均出现肢体颤动、咬尾等神经中毒表现。病毒注射超过5 d后，大多数小鼠会因PRV引起的毒性反应而死亡。

利用PRV-EGFP从脊髓呼吸膈运动神经元逆行示踪，对注射病毒4.5～5.0 d后的小鼠脑片行全脑扫描，发现脊髓呼吸膈运动神经元上游呼吸相关核团大多数位于延髓，包括preBötC、rVRG、包钦格复合体(Bötzinger complex, BötC)、NTS等，部分位于脑桥(如LC)、中脑(如PAG)以及小脑[如前庭核(vestibularnuclei, Ve)等],另一部分则位于下丘脑[如：PVN、外侧下丘脑(lateral hypothalamic, LH)等]、杏仁核(central amygdala, CeA)、皮层等区域(图2)。

为了统计脑内主要呼吸相关核团中PRV-EGFP阳性神经元的数量，选取了皮层、PVN、LH等14个核团进行人工计数。同时为了更详细地显示被PRV-EGFP标记的神经元，选择以下主要核团的冠状图像进行共聚焦拍摄，包括：皮层、外侧隔核(lateral septal nucleus, LS)、CeA、PVN、LH、PAG、LC、未确定带(zona incerta, ZI)、Ve、Gi、NTS、preBötC等(图3A)。

本研究统计分析了脑内几个主要呼吸相关核团中被PRV-EGFP标记的神经元数量在整个大脑被标记的神经元总数量的比例。结果显示：延髓区域占比最高，其中NTS占(8.387±1.965)%,rVRG占(4.193±0.263)%,BötC占(3.263±0.851)%,preBötC占(3.970±0.252)%,Gi占(18.850±3.271)%。其次为下丘脑，其中PVN占(12.790±0.595)%,LH占(4.753±0.568)%,ZI占(3.493±0.751)%。中脑：PAG占(11.680±2.799)%。脑桥：LC占(4.960±1.187)%。小脑：Ve占(2.003±0.407)%。皮层占(4.300±1.524)%。CeA占(4.957±1.528)%。LS占(0.430±0.130)%。各脑区PRV-EGFP阳性神经元占比的差异有统计学意义(F=12.08,P<0.000 1,图3B)。上述被PRV-EGFP标记的核团与脊髓呼吸膈运动神经元都有直接或间接的投射关系。根据PRV逆行示踪及全脑扫描和共聚焦拍片的结果，初步绘制小鼠全脑呼吸相关核团分布图(图4)。

图1 PRV-EGFP注入后不同时间点PRV-EGFP阳性神经元在各脑区的差异

图2 PRV-EGFP注入后全脑PRV-EGFP阳性神经元分布图

根据小鼠脑图谱标记各区域，图中左上角的黄色数字代表各区域所在深度Cortex:皮层;PVN:下丘脑室旁核；ZI:未确定带；CeA:中央杏仁核；LH:外侧下丘脑；RN:红核；DpMe:中脑深部核；PB:臂旁核；LC:蓝斑；Ve:前庭核；LSO:外侧上橄榄核；7N:面神经核；DPGi:背侧旁巨细胞核；Gi:网状核；IRT:中间网状核；GiA:巨细胞网状核；PMn:旁正中网状核；IO:下橄榄核；PAG:中脑导水管周围灰质；DR:中缝背核；NTS:孤束核；preBötC:前包钦格复合体；BötC:包钦格复合体；rVRG:嘴端腹侧呼吸组

2.2 PVN-preBötC环路及二者之间直接投射

为了明确PVN与preBötC有无直接突触联系，在PVN定位注射AAV2/9-EGFP(顺行不跨突触病毒),待小鼠病毒感染4周后，在preBötC脑区观察到了绿色的神经纤维(图5)。

为了进一步验证PVN与preBötC之间直接突触联系，利用Cre/loxP系统与不跨突触病毒相结合，在小鼠preBötC注射Retro-Cre,在PVN注射Dio-EGFP,从而限定PVN-preBötC环路，结果在PVN脑区找到绿色神经元胞体(图6)。且胞体大多集中在PVN的腹侧区域即PVNmpv区域，这里包含了大部分下行的自主神经前神经元(图6C)。

图3 PRV-EGFP注入后部分脑区PRV-EGFP标记的阳性神经元分布图及各脑区阳性神经元占比

A: PRV-EGFP注入5 d后各脑区PRV-EGFP阳性神经元局部图；B:各主要脑区被PRV-EGFP标记的阳性神经元占比情况Cortex:皮层；LV:侧脑室；LS:外侧膈核；CeA :中央杏仁核；BLA:基底外侧杏仁核；PVN:下丘脑室旁核；3V:第三脑室；LH :外侧下丘脑；ZI:未确定带；PAG:中脑导水管周围灰质；Aq:中脑导水管；LC:蓝斑；4V:第四脑室；Ve:前庭核；Raphe:中缝；preBötC:前包钦格复合体；Gi:网状核；DR:中缝背核；AmbC:疑核；NTS:孤束核

图4小鼠全脑主要呼吸相关核团分布区

图5小鼠PVN与preBötC的直接投射关系

图6小鼠PVN-preBötC环路及二者之间投射关系

3、讨论

人类呼吸运动的维持是在脑干呼吸中枢呼吸模式和节律的产生以及脑桥呼吸调节中枢和高位脑呼吸相关脑区等呼吸神经网络的协同作用下完成的[3, 38]。因此研究整个呼吸中枢神经网络的解剖结构分布、潜在回路、神经及生理机制等对呼吸障碍相关性疾病的靶向诊治至关重要。本研究基于PRV的神经示踪技术，Cre/loxP系统以及多种显微成像技术，全面解析了小鼠全脑呼吸相关核团的空间分布，同时验证了PVN-preBötC环路以及二者之间直接投射关系。

3.1绘制全脑呼吸相关核团空间分布，PVN是脊髓呼吸膈运动神经元重要的上游输入核团

PRV属于疱疹病毒科，具有逆向跨多级突触连接的特性。将其注入外周组织后，可依次感染与该组织相连接的上游神经结构，包括周围神经、脊髓及大脑区域相关脑区。PRV不感染人及灵长类动物，是目前解析啮齿类动物神经环路研究的重要工具[39]。由于PRV是通过逆向感染神经传导通路内的神经元[40],因此所观测到的PRV阳性神经元是分布在脊髓呼吸膈运动神经元下行神经传导通路中，这些神经元与膈运动神经元有直接或间接的突触联系。在之前的实验中，课题组根据脊髓区域PRV-EGFP阳性神经元的分布，绘制了全脊髓呼吸相关核团图谱。故此次研究主要针对全脑呼吸相关核团的描述。本研究结果显示：PRV-EGFP病毒注入小鼠膈肌后感染的时间长短不同，脑中PRV-EGFP阳性神经元分布脑区出现的时间先后及感染神经元数量的多少亦有所不同。PRV-EGFP病毒似乎更先到达皮层(主要是M1区)、PVN、preBötC等核团。但PRV在中枢内的传播速度以及跨突触传播的级数是根据PRV的生活周期推测的，故想要明确哪个核团是脊髓呼吸膈运动神经元的直接上一级脑区，则需利用不跨突触或跨单突触传播的病毒示踪进一步验证[39]。但是从上述实验结果可以看出除延髓区域外，皮层和PVN似乎是与脊髓呼吸膈运动神经元联系相对更紧密的核团。

PRV-EGFP注射4.5～5.0 d后在全脑范围内标记PRV-EGFP阳性神经元。这些被标记的核团均是“经典”的呼吸相关核团，且与脊髓呼吸膈运动神经元之间存在直接或间接突触联系。研究认为呼吸起源于脑干的中央模式发生器(central pattern generator, CPG),包括preBötC、BötC以及腹侧呼吸组(ventral respiratory group, VRG)等[1],其中preBötC被一致认为可能与呼吸节律起源密切相关[14]。位于延髓背侧的NTS,是心肺感受器传入神经冲动在中枢整合的重要部位[41-47],脑桥的臂旁核、LC等与呼吸模式的调节以及吸气/呼气相的转换等有关[48-49]。FAULL等[50]和MCGOVERN等[51]报道PAG在呼吸障碍调控中发挥重要作用。除此之外，也有研究发现小鼠的大脑皮层、上丘、CeA、下丘脑等脑区会发送投射至preBötC神经元[4, 52]。这些投射可能参与呼吸调控的潜在通路[8, 53-54]。从各脑区被标记的PRV-EGFP阳性神经元所占的比例来看，除延髓区域以外，下丘脑区域，特别是PVN脑区所占比例最高。可见PVN在呼吸中枢神经网络中的重要性。

3.2 PVN-preBötC环路存在且二者之间有直接投射关系

下丘脑是间脑腹侧的灰质，调节各种自主脑功能。并且有研究报道，下丘脑与呼吸调控密切相关[16-21]。其中PVN是下丘脑参与呼吸控制的主要核团。PVN包含大量神经元，其中包括与心肺功能调节相关的催产素神经元、加压素神经元以及去甲肾上腺素神经元等[23, 55-56],近年来通过神经示踪技术，描述了PVN传出纤维投射到达神经元群的多样性，每一组在控制呼吸网络中的位置和功能不同，这些结构包括位于脑桥、延髓、脊髓以及包含驱动呼吸肌的运动神经元[23-26, 57]。但并没有直接证据证明PVN与这些神经元之间是否存在直接突触联系，这一漏洞一直被用来质疑PVN在呼吸中枢神经网络调控中的作用。

preBötC神经元是CPG的核心[1]。本研究利用不跨突触示踪技术，在PVN注射AAV2/9-EGFP病毒。不跨突触病毒不能多级传导，只能靶定上下一级脑区。待病毒感染后在preBötC脑区找到了绿色的神经纤维，说明PVN是preBötC的直接上一级输入核团。由于DIO元件的病毒只有在Cre动物模型中才会表达，故本研究运用Cre/loxP系统和AAV血清型(如rAAV2/9或rAAV2/retro等)相结合，以实现对神经环路标记和功能特异性研究的目的。在PVN注射Dio-EGFP,在preBötC注射Retro-Cre病毒，从而限定了PVN-preBötC环路，待病毒感染后，在PVN脑区找到绿色神经元胞体，证明了PVN-preBötC环路的存在。由于病毒不跨突触传播，亦可证明二者之间有直接突触联系，更加验证了PVN在呼吸中枢神经网络中至关重要的解剖学位置。然而这些结果只能证明PVN具备了参与呼吸调控的有利“地理位置”和与脑干联系的直接“通路”。它有可能通过PVN-preBötC环路的直接投射调控呼吸。但PVN在呼吸调控中的具体作用机制目前我们仍不能确定，还需在后期PVN对呼吸调控的功能研究中进一步验证。众所周知，PVN包含大量神经元，且与多个呼吸相关核团有投射关系，在不同压力源的作用下，PVN中代表不同递质类型的神经元会受到不同的动员，从而启动与不同呼吸运动调控脑区的投射联系。而PVN与其他呼吸核团之间是否也存在特定的神经环路联系以及各种投射环路之间是如何协调的，还有待进一步的实验来验证。

综上，呼吸是维持人类生命活动的重要生理过程。呼吸障碍相关性疾病严重降低人类的生活质量，亟需找到新的诊治突破口。本研究利用神经示踪技术，描绘了呼吸中枢神经网络全脑主要呼吸相关核团空间分布图，并通过Cre/loxp系统和不跨突触示踪技术相结合，验证了PVN-preBötC环路以及二者之间的直接投射关系，证实了PVN在呼吸中枢神经网络中的重要位置。且PVN有可能通过PVN-preBötC环路的直接投射调控呼吸。为下一步PVN对呼吸调节机制的研究提供解剖学依据，同时也为呼吸障碍性疾病从中枢层面的靶向治疗提供了新的思路。

基金资助:国家重点研发计划(2018YFC2000301)~~;

文章来源:刘凌琳,张俊鸿,熊玮.小鼠的下丘脑室旁核向前包钦格复合体直接投射参与调控呼吸[J].陆军军医大学学报,2024,46(20):2265-2275.