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罗沙司他对慢性肾衰竭致肾性贫血大鼠肾损伤治疗效果

2024-11-25 2 上传者：管理员

摘要：目的分析罗沙司他对慢性肾衰竭致肾性贫血大鼠肾损伤的治疗效果及作用机制。方法将36只大鼠随机分为假手术组、模型组和罗沙司他组各12只。模型组和罗沙司他组均复制慢性肾衰竭模型。建模成功后，罗沙司他组以27 mg/kg剂量灌胃罗沙司他溶液；其余组灌胃等量的去离子水，均干预8 w。苏木素-伊红染色观察肾脏组织病理改变。血液生化仪检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。收集大鼠24 h尿液，双缩脲法检测24 h尿蛋白(24 h Upro)。酶联免疫吸附试验检测血清铁(SI)、总铁结合力(TIBC)、铁蛋白(FER)、铁调素(Hepcidin)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、C-反应蛋白(CRP)。血液细胞分析仪检测血红蛋白(Hb)、血细胞比容(HCT)和血红细胞(RBC)。Western印迹法检测肾脏组织脯氨酸羟化酶(PHD)-2、低氧诱导因子(HIF)-2α蛋白表达。结果模型大鼠经罗沙司他干预后病理改变得到明显改善。慢性肾衰竭大鼠Scr、BUN、24 h Upro、IL-6、TNF-α、CRP、Hepcidin水平明显上升，RBC、Hb、HCT、SI、FER、TIBC水平明显下降(P<0.05);经罗沙司他干预后Scr、BUN、24 h Upro、IL-6、TNF-α、CRP、Hepcidin水平明显下降，RBC、Hb、HCT、SI、FER、TIBC水平均明显升高(P<0.05)。慢性肾衰竭大鼠PHD-2蛋白表达显著上升，HIF-2α蛋白表达显著下降(P<0.05);经罗沙司他干预后PHD-2蛋白表达显著下降，HIF-2α蛋白表达显著上升(P<0.05)。结论慢性肾衰竭大鼠经罗沙司他干预后提高肾功能，降低炎症因子水平，纠正铁代谢紊乱状态，其可能是通过PHD/HIF/Hepcidin信号轴防治肾性贫血。

关键词：
内分泌代谢功能
慢性肾衰竭
罗沙司他
肾性贫血
肾脏病变
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慢性肾衰竭又称为慢性肾功能不全，主要是由于长期的肾脏病变，肾单位受到摧毁而减少，随着时间推移和病情发展，致使肾脏排泄调剂功能和内分泌代谢功能严重受损而造成水与电解质、酸碱平衡紊乱，肾脏功能逐渐下降，进而诱发肾衰竭[1,2]。肾性贫血是慢性肾衰竭患者临床常见的并发症，这种并发症一旦发生不仅影响患者生活质量，同时还会增加患者心血管疾病、脑卒中的风险，进而导致患者再住院甚至死亡[3]。临床治疗中多以患者治疗后贫血的程度判断患者的临床治疗效果，因此，有效改善患者贫血症状是治疗慢性肾衰竭中关键的一环。有研究报道，在低氧状态下低氧诱导因子(HIF)被激活，参与调节铁平衡和红系造血，在贫血发生发展过程中扮演重要角色[4]。作为全球首个通过稳定HIF治疗肾性贫血的脯氨酰羟化酶(PHD),罗沙司他具有全新的药理机制，有效解决肾性贫血患者的诸多困扰，成为治疗肾性贫血的重要药物[5]。既往研究显示[6],采用罗沙司他治疗慢性肾衰竭肾性贫血患者具有良好的短期疗效，具有较高的临床应用价值。本研究基于肾性贫血发生的病理机制分析罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠肾性贫血治疗及其可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1实验动物

无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠36只，体质量210～220 g,购于海南药物研究所有限责任公司，许可证号：SCXK(琼)2020-0007;在标准环境中饲养，光照12 h,黑暗12 h,相对湿度40%～60%,温度20～23℃。实验动物均遵循3R原则，经动物实验伦理审查通过。

1.2实验药物

罗沙司他胶囊[生产厂家：珐博进(中国)医药技术开发有限公司；批准文号：国药准字H20180024;规格：50 mg×3粒胶囊剂],将罗沙司他溶解于去离子水中，确保最终浓度为5 mg/ml,低温保存备用。

1.3主要试剂与仪器

苏木素-伊红(HE)染色液购于中山市奥博生物科技有限公司；光学显微镜购于深圳市力创仪器有限公司；酶联免疫吸附试验(EELISA)试剂盒购于广州奥瑞达生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)购于北京伊塔生物科技有限公司；迈瑞BC-10全自动血液细胞分析仪购于南京贝登医疗股份有限公司；PHD-2、HIF-2α、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购于北京伊诺凯科技有限公司；腺嘌呤购于陕西晨明生物科技有限公司。

1.4慢性肾衰竭模型建立与分组

将36只大鼠随机分为假手术组、模型组和罗沙司他组各12只。采用单侧肾脏切除术联合腺嘌呤灌胃联合法复制慢性肾衰竭模型。除假手术组外，其余组经麻醉后，对大鼠左侧背部肾区备皮并消毒，在其左侧背部肾区处做长度约为1 cm的纵向切口，取出大鼠左侧肾脏，将肾动脉结扎，再将左肾脏切除后止血。术后依次缝合伤口，对切口区域进行消毒处理。必要时给予抗生素预防切口感染。术后2 w,对模型组和罗沙司他进行腺嘌呤(1 ml/100 g)灌胃，假手术组正常饮食并灌胃等量的去离子水，均持续12 w。建模成功标准参考文献[7]。

1.5药物干预

造模成功后对各组给予药物灌胃干预，按照大鼠与60 kg成人的体表面积换算公式[8]算出不同组大鼠灌胃药量。罗沙司他组以27 mg/kg剂量灌胃罗沙司他溶液，1次/d。其余组均给予等量去离子水灌胃。所有大鼠干预8 w。

1.6样本采集及指标检测

大鼠给药结束后，经麻醉后于肱动脉采血3 ml,离心分离取上清液，采用血液生化仪检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。收集大鼠24 h尿液，采用双缩脲法检测24 h尿蛋白(24 h Upro)。采用ELISA检测血清铁(SI)、总铁结合力(TIBC)、铁蛋白(FER)和铁调素(Hepcidin)。血常规：采用血液细胞分析仪检测血红蛋白(Hb)、血细胞比容(HCT)和血红细胞(RBC)。炎症因子：采用ELISA检测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、C-反应蛋白(CRP)。

1.7 HE染色

断颈法处死麻醉后大鼠，手术方法剥离大鼠肾组织，多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片后，经HE染色后于光学显微镜下观察并拍照。

1.8 Western印迹法

采用断颈法处死大鼠，手术剥离肾脏组织，利用放射免疫沉淀法缓冲液裂解液萃取心肌组织蛋白。然后采用BCA法将各组蛋白样品定量至相同浓度后，取20μg样品蛋白加入SDS-PAGE分离后转至聚偏氟乙烯膜，脱脂牛奶封闭。加入稀释的抗体(1∶5 000),4℃孵育过夜。加入液稀释的二抗(1∶1 000),以GAPDH作为内参，增强型化学发光化学液进行显影，拍照。

1.9统计学分析

采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2、结果

2.1罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠肾脏组织形态学的影响

与假手术组相比，模型组肾脏组织系膜细胞增生，肾小球数量减少，部分萎缩、硬化坏死、代偿性扩张，球囊壁粘连，肾小管萎缩、坏死与明显扩张，上皮细胞坏死、凋亡；肾间质与小管分界模糊不清，可见大量炎症细胞浸润及纤维化。与模型组相比，罗沙司他组可见少量炎性细胞浸润及轻度纤维化，肾小管管腔轻度扩张，部分萎缩、坏死，肾小球轻度扩张，部分粘连。见图1。

2.2罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠肾功能影响

与假手术组相比，模型组Scr、BUN和24 h Upro水平明显上升(P<0.05);与模型组相比，罗沙司他组上述指标明显下降(P<0.05)。见表1。

2.3罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠血常规的影响

与假手术组相比，模型组RBC、Hb和HCT水平均明显下降(P<0.05);与模型组相比，罗沙司他组RBC、Hb和HCT水平均明显升高(P<0.05)。见表1。

图1各组肾脏组织形态学(HE染色，×400)

表1各组肾功能及血常规指标比较

2.4罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠炎症指标的影响

与假手术组相比，模型组血清IL-6、TNF-α和CRP水平均明显上升(P<0.05);与模型组相比，罗沙司他组血清IL-6、TNF-α和CRP水平均明显下降(P<0.05)。见表2。

表2罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠炎症指标的影响

2.5罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠肾脏组织PHD-2、HIF-2α蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组肾脏组织PHD-2蛋白表达明显上升，HIF-2α蛋白表达明显下降(P<0.05);与模型组相比，罗沙司他组肾脏组织PHD-2蛋白表达明显下降，HIF-2α蛋白表达明显上升(P<0.05)。见图2、表3。

2.6罗沙司他对慢性肾衰竭大鼠铁代谢及Hepcidin指标的影响

与假手术组相比，模型组SI、FER、TIBC水平明显下降，Hepcidin水平明显升高(P<0.05);与模型组相比，罗沙司他组SI、FER、TIBC水平明显升高，Hepcidin水平明显下降(P<0.05)。见表3。

图2各组肾脏组织PHD-2、HIF-2α蛋白表达

表3各组铁代谢和Hepcidin指标及肾脏组织中PHD-2、HIF-2α蛋白表达比较

3、讨论

一般情况下，慢性肾衰竭持续恶化会导致机体红细胞生成素减少，从而影响红细胞功能，导致出现贫血症状，可加重患者病情，诱发心力衰竭[9～12]。目前临床可采用重组人促红细胞生成素和铁剂等药物治疗肾性贫血症状，但慢性肾衰竭患者多存在微炎症环境及对铁利用的障碍，造成疗效不理想。同时患者处于较高的Hb水平会增加心脑心血管疾病的发生风险。罗沙司他作为低氧诱导因子脯氨酰羟化酶(HIF-PHI),可营造低氧环境，诱导并激活HIF,增加内源性促红细胞生成素，且不受炎症因子的影响，减低Hepcidin,促进铁的吸收、转运和利用，进而改善贫血症状[13]。

Scr是含氮的有机物，BUN是蛋白质的终末产物，可在一定程度上反映肾小球滤过功能的损害程度[14,15]。24 h Upro可以反映肾脏的功能。既往研究显示，肾性贫血患者采用生血宁片联合罗沙司他治疗可有效降低机体，Scr、BUN和24 h Upro水平，这与本研究结果相似[16]。本研究结果表明，罗沙司他可有效改善慢性肾衰竭大鼠肾小球滤过功能，发挥保护肾功能的作用。RBC、Hb和HCT是衡量贫血情况的重要指标，其中铁缺乏是导致慢性肾脏病患者贫血的常见原因，铁是Hb、肌红蛋白、FER等的重要组成成分[17]。既往研究显示[18],血液透析肾性贫血患者经罗沙司他治疗后，RBC、Hb和HCT水平明显升高，贫血症状得到明显改善。本研究结果表明，罗沙司他干预慢性肾衰竭大鼠可有效改善贫血症状。

肾性贫血主要是由于肾脏疾病原因造成血液中的血色素低于正常，而出现贫血的症状，可加速肾功能恶。肾性贫血发生过程比较复杂，目前认为慢性肾衰竭肾性贫血患者多存在微炎症。既往研究显示[19],慢性肾衰竭肾性贫血老年患者经罗沙司他胶囊治疗后临床疗效确切，其显著降低患者体内炎症指标(IL-6、TNF-α和CRP),这与本研究结果相似。本研究结果显示，罗沙司他干预慢性肾衰竭大鼠后可显著改善大鼠体内微炎症状态。铁代谢失调可能是慢性肾衰竭贫血的主要原因，Hepcidin是肝脏产生的肽类激素，是机体中重要的铁代谢调节因子，在治疗慢性肾衰竭贫血时，降低Hepcidin水平至关重要。既往研究显示[20],慢性肾脏病并肾性贫血患者口服罗沙司他可明显改善患者铁代谢，有效缓解贫血症状，这与本研究结果相似。本研究结果表明，罗沙司他干预慢性肾衰竭大鼠后可显著纠正铁代谢紊乱，进而改善贫血症状。本研究还说明，罗沙司他可能是通过PHD/HIF/Hepcidin信号轴发挥改善慢性肾衰竭肾性贫血症状的作用。PHD/HIF/Hepcidin信号轴在肾性贫血发生发展中扮演重要角色，已成为目前治疗肾性贫血的新方向。PHD是提眉HIF降解的限速酶，可调节下游HIF-2α的生成[21]。HIF降解可抑制体内Hepcidin水平，促进体内铁元素的吸收和利用，对体内铁代谢调节具有重要作用。Hepcidin是体内调节铁代谢的重要负性调控因子，Hepcidin水平升高，能够抑制肠道对铁的吸收和利用，降低SI水平[22]。

综上，罗沙司他干预慢性肾衰竭大鼠的肾性贫血具有良好的治疗效果，有效提高大鼠肾功能，调节机体铁代谢，并且具有降低炎症反应的作用，其作用机制可能是通过调控PHD/HIF/Hepcidin信号轴发挥改善肾性贫血及肾功能的作用。本研究仅为基础动物实验，对其是否通过调控PHD/HIF/Hepcidin信号轴改善慢性肾衰竭肾性贫血症状还需大量临床数据进一步验证。

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