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血浆蛋白质组中介分析揭示硒与肾功能间的因果关系及机制

2024-08-09 18 上传者：管理员

摘要：目的探讨体内硒水平与肾功能间的因果关系，并评估血浆蛋白质组在硒水平与肾功能关系中的中介作用，以了解硒影响肾功能的机制。方法与硒水平相关的变异是从欧洲人群循环硒水平和足趾甲硒水平的大型全基因组关联研究(GWAS)荟萃分析中提取的。肾功能数据来自GWAS荟萃分析。血浆蛋白质组数据来自人类血浆蛋白质组基因组图谱。利用两样本两步孟德尔随机化(MR)方法研究硒水平与肾功能之间的因果关系及血浆蛋白质组在其中的介导作用。并通过生物信息学方法对中介蛋白进行富集分析，以探究硒对肾功能影响的潜在机制。结果 MR分析发现，硒水平增加会导致估计肾小球滤过率(eGFR)显著降低[OR(95%CI):0.997(0.996～0.999),P=0.001],未检测到异质性和水平多效性。通过中介分析确定了包括成纤维细胞生长因子受体(FGFR)4、纤维蛋白(FBLN)1、纤毛和鞭毛相关蛋白(CFAP)45在内的35个血浆蛋白参与介导了硒对eGFR水平的影响。对中介蛋白的富集分析发现，包括FGFR4突变受体激活和溶质载体家族5成员(SLC5A)5缺陷导致甲状腺激素生成异常在内的13个信号转导通路被确定为硒影响eGFR的介导途径。结论体内硒水平增高是导致肾功能下降。

关键词：
中介分析
孟德尔随机化分析
硒
肾功能
血浆蛋白质组
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慢性肾脏病(CKD)是指肾脏结构或功能出现异常，持续时间超过3个月，并对健康产生特定影响[1]。CKD可发展为终末期肾脏病(ESRD),一旦进入ESRD需进行肾脏替代治疗(肾移植或透析)以维持生命。我国人群的CKD患病率为10.8%,患者人群高达1.3亿[2]。年龄是CKD的重要危险因素之一，老年人群的CKD患病率更高[3]。随着人口老龄化的加剧及高血压、糖尿病和肥胖等危险因素发病率的迅速增加，未来CKD的患病率将进一步增加，给社会带来了沉重的负担。因此，CKD作为一个重大公共卫生问题，受到了越来越多的关注。

硒是哺乳动物必需的微量元素，广泛分布于人体的各个组织[4]。硒元素本身没有生物活性，它以硒半胱氨酸和硒蛋氨酸的形式参与体内25种硒蛋白的合成，从而发挥其生物功能[5]。硒蛋白在人体内发挥着重要功能，如对抗氧化应激、调节免疫系统、调节甲状腺素代谢和生育能力等[6]。然而，约有50%的硒蛋白生物活性尚不清楚，其生物学作用也有待阐明[7]。肾脏是硒在人体内分布最广的器官[8]。研究发现，硒与CKD之间存在密切联系[9～11]。CKD患者硒水平通常低于正常人[12],而血浆硒水平也会随着年龄的增长而降低[13],因此老年CKD患者硒水平通常更低，但是补充硒是否能使CKD患者受益仍存在争议[14,15]。

孟德尔随机化(MR)是一种利用遗传变异作为工具变量来研究暴露因素是否对健康结果产生因果影响的研究方法[16]。与传统方法相比，MR可以避免反向因果关系偏差，减少混杂因素的干扰，因此在流行病学研究中被广泛应用[17]。许多循环蛋白质是分子通路的重要调节因子[18],而全基因组关联研究(GWAS)揭示了与血浆蛋白质组水平相关的基因变异[19,20],这为利用MR方法进一步揭示暴露与结局间因果关系的背后机制提供了可能。本研究采用双样本MR方法探讨硒与肾功能之间的关系，并进一步经评估3 282个循环血浆蛋白质在硒水平与肾功能关系中的潜在中介效应，以了解硒水平影响肾功能的机制。

1、材料和方法

1.1总体研究设计

采用两样本两步MR法，分3个阶段研究血浆蛋白质组在硒水平与肾功能因果关系中的潜在中介效应。①以足趾甲硒浓度和血硒浓度反映体内硒水平，首先确定体内硒水平对肾功能的因果效应。②分别研究体内硒水平对血浆蛋白质组的因果效应及血浆蛋白质组对肾功能的因果效应。③研究和量化血浆蛋白质组在硒水平与肾功能之间的潜在中介作用，并通过生物信息学对中介蛋白进行富集分析，锚定相关信号通路以了解硒影响肾功能的潜在机制。

1.2 GWAS数据来源

与硒水平密切相关的工具变量来自对趾甲和血硒的大型GWAS元分析[21]。趾甲硒浓度采集自美国4个队列中的4 162名欧洲后裔[22～25]。血硒浓度从2 603对澳大利亚双胞胎及其家庭和2 874名英国孕妇中收集[26]。血浆蛋白质组水平的GWAS总结数据来自人类血浆蛋白质组基因组图谱[19]。肾功能[肾小球率过率(eGFR)]的GWAS汇总数据来自英国生物库(n= 436 561)和慢性肾脏病遗传学(CKDGen)联盟(n=765 348)[27]。

1.3工具变量的选择

为确保分析的可靠性，必须满足MR的3个核心假设[28]:(1)工具变量与暴露密切相关；(2)工具变量独立于任何混杂因素；(3)工具变量仅通过暴露而非其他因果途径影响结果。因此，选择与暴露相关的全基因组显著水平(P<5×10-8)的单核苷酸多态性(SNP),剔除存在连锁不平衡、不明确的及重码的SNP。此外，计算每个SNP的F统计量，F统计量<10的SNP定为弱工具变量，将被剔除[29]。经过MR-PRESSO检验、MR-Steiger检验、PhenoScanner检验严格筛选后，剩下的SNP被认为是合格的工具变量。

1.4 MR分析

应用逆方差加权(IVW)、MR-Egger回归、加权中位数(WM)和MR稳健性评分(MR-RAPS)4种MR方法计算暴露和结局的因果效应。IVW方法是本研究的主要分析方法，利用荟萃分析将SNPs的比值估计值与方差反加权相结合，得出风险因素对结果影响的估计值。

1.5敏感性分析

敏感性分析主要包括水平多效性、异质性检验和留一法分析。水平多效性采用MR-Egger法进行评估，P<0.05时，认为工具变量受到水平多效性的影响严重，结果不可靠。使用CochranQ检验来评估异质性，当Q-P值小于0.05时，异质性显著。存在异质性时采用随机效应IVW模型，否则采用固定效应IVW模型作为主要分析方法。本文进行了留一法分析并绘制漏斗图。此外，还进行MR-Steiger检验，确定总体因果方向是否正确。最后，计算统计功效明确阴性结果的可靠性。

1.6血浆蛋白质中介分析及通路富集分析

中介分析包括硒水平对血浆蛋白质组的中介分析和血浆蛋白质组对肾功能的中介分析。在这两步MR分析中均有意义的血浆蛋白质被认为具有中介效应。中介效应由第一步和第二步的效应相乘计算得出，中介效应率是指中介效应占总效应的比例。然后对发现的中介蛋白在Reactome数据库中进行通路富集。

1.7统计学分析

采用R(4.3.1版)和R软件包TwoSample MR、MR-PRESSO、mr.raps,利用漏斗图评估可能的方向效应和多效性，并检查数据的分布情况。绘制森林图估计最终的因果关系，展示每个SNP的结果和整个MR分析的结果。

2、结果

2.1筛选工具变量

初步筛选了12个与硒水平相关的SNPs。排除了4个可能与结局直接相关的SNPs,最终有8个合格的SNPs被纳入研究，它们主要来自5号和21号染色体，且与体内硒水平的变化密切相关，见图1、图2、图3。在中介MR分析中，初步筛选了249 286个与各血浆蛋白质水平相关的SNPs。剔除了49 690个在结局GWAS数据中缺失的SNP及23 526个模糊SNP和回文SNP。之后进行Bonferroni校正，发现有3 203个SNP与结局直接相关，将他们剔除。最终172 870个合格的SNPs被纳入研究。

2.2 MR分析

利用MR方法探究体内硒水平与肾功能间的因果关系发现，体内硒水平的增加会降低eGFR水平[OR(95%CI):0.997(0.996～0.999),P=0.001],CochranQ检验未检测到异质性(P=0.429)。MR-Egger也未检测到水平多效性(P=0.961 7),提示结果可靠，表明体内硒水平的增加会导致肾功能下降，因此对CKD患者补硒应非常慎重。血浆蛋白质组介导的中介MR分析发现，成纤维细胞生长因子受体(FGFR)4、纤维蛋白(FBLN)1、纤毛和鞭毛相关蛋白(CFAP)45等35种血浆蛋白参与介导了体内硒水平对eGFR的影响，介导效应率从1.59%～23.70%,见图4、图5。

图1硒的工具变量森林图

图2 GWAS硒水平汇总数据的曼哈顿图

图3硒水平与eGFR关系的MR散点图和回归曲线

图4血浆蛋白质组两步中介效应及总效应森林图

图5血浆蛋白组两步中介效应散点图

2.3代谢和信号通路富集分析

在Reactome数据库中对介导硒影响eGFR的中介蛋白进行富集分析发现，包括FGFR4突变受体激活(通路识别个数5/5,节点识别个数1/1,P=0.004)、溶质载体家族5成员(SLC5A)5缺陷导致甲状腺激素生成障碍1(通路识别个数1/1,节点识别个数1/1,P=0.004)在内的11条通路参与介导了体内硒水平对eGFR的影响，见图6。

图6中介蛋白通路富集分析

3、讨论

饮食摄入是体内硒来源的主要途径[30],但中国土壤中硒含量较低，人们无法从饮食摄入足够的硒[31],且老年人普遍存在鱼类、海鲜、肉类摄入相对不足的问题，也有研究表明，随着年龄的增长，体内硒水平呈下降趋势[13],因此老年CKD患者更有可能在没有专业指导的情况下进行补硒。硒本身没有生物活性，主要通过硒蛋白发挥生物效应[5]。尽管某些硒蛋白如硒蛋白P和谷胱甘肽过氧化物酶等具有抗氧化等有益作用[32,33],但也有一些硒蛋白具有潜在的有害作用，如谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)1与胰岛素抵抗和2型糖尿病有关[34]。然而，大多数硒蛋白的生物效应，尤其是对肾脏的效应仍不清楚。此外，硒是否有益与其剂量和形式有关[35]。当硒摄入过多，硒蛋白的表达趋于饱和，剩余的硒将主要以非特异性含硒蛋白的形式存在[36],通过硒蛋氨酸(SeMet)取代蛋氨酸非特异性地融入人体蛋白，对健康造成损害[37]。CKD患者的特点是膳食摄入量减少、肠道吸收减少、尿蛋白排泄增加及合成硒蛋白的能力下降[38]。因此，在补充硒时，他们更容易出现硒蛋白饱和，从而受到硒的毒性影响。本研究结果发现，硒含量的增加会导致肾功能下降，因此对CKD患者补硒应非常谨慎。

许多循环蛋白是分子通路的关键调控因子，因此探讨它们在硒水平与肾功能关联中的潜在中介效应有助于了解硒影响肾功能的潜在机制。CKD患者血清中成纤维细胞生长因子(FGF)水平升高，其中FGF23与心血管疾病发病率、慢性炎症和肾病进展有密切的剂量依赖关系[39]。FGFR4是FGF23的受体之一。FGFR4参与体内多种器官慢性炎症反应和肾脏纤维化，如肝脏FGFR4的激活会导致肝脏产生炎症细胞因子，从而加剧体内的慢性炎症并参与CKD进展[40]。此外，有研究表明，FGF23可通过FGFR4促进损伤中局部肾脏成纤维细胞的活化并延续促纤维化信号，从而参与肾脏纤维化[41]。CFAP45蛋白是纤毛轴丝的静态结构成分，对运动纤毛的稳定性至关重要[42]。纤毛广泛分布于肾脏的近端和远端肾小管及集合管。纤毛的正常结构和功能对肾脏的器官形成和维持上皮细胞的分化和增殖至关重要，而持续的纤毛功能障碍会导致早期和进行性肾脏疾病[43]。然而，关于CFAP45与肾脏关系的研究还很缺乏，其对肾纤毛和肾功能的影响有待今后进一步探讨。

硒对甲状腺素的生物合成非常重要。甲状腺素生物合成过程中会产生活性氧损伤甲状腺细胞，甲状腺表达谷胱甘肽过氧化物酶、硒蛋白P和硫氧还原酶等硒蛋白，它们共同组成抗氧化系统，减轻损伤，从而维持甲状腺组织的正常功能[44]。此外，硒对甲状腺素的代谢也非常重要。碘甲腺原氨酸脱碘酶也是一种硒蛋白。非活性前体甲状腺素通过碘甲腺原氨酸脱碘酶转化为活性三碘甲状腺原氨酸。体内硒含量异常会影响碘甲腺原氨酸脱碘酶的表达和活性，从而导致甲状腺素代谢紊乱[45]。肾脏是甲状腺素作用的重要靶器官。甲状腺素会影响蛋白质合成和细胞生长，在肾脏的生长发育中起着重要作用[46]。甲状腺素通过调节肾小管离子转运体(1个Na+、1个K+、2个Cl-协同转运蛋白等)的活性，从而调节肾小管反馈并影响eGFR[47]。它还能调节肾小球血管扩张因子(如血管内皮生长因子)的表达及肾素-血管紧张素-醛固酮系统各种成分的合成和分泌，从而调节肾脏灌注[48]。此外，研究还发现，甲状腺素的异常增减与肾脏纤维化的发生和发展密切相关[49,50]。这些证据支持了本研究的结果，即对甲状腺素的影响可能是硒影响肾功能的一个潜在机制。

本研究存在一定的局限性。首先，纳入的数据是针对欧洲血统的个体进行的，暂不能将研究结果推广到其他种族人群。其次，人群中的硒水平与地域密切相关，因此也限制了将研究结果推广到不同地域人群的可能性。第三，数据来自公开的综合统计数据，无法获得每个人的原始临床结果数据，因此无法进行进一步的人群分层分析。

综上，硒水平升高是肾功能损害的一个致病因素，提示CKD患者补硒应非常慎重。本研究揭示了硒水平升高是导致肾功能恶化的潜在机制。

参考文献:

2杨超,张路霞,赵明辉.《中国慢性肾脏病早期评价与管理指南》解读[J].中国实用内科杂志,2023;43(10):839-41,76.

文章来源:钱漫,孙志国,付少杰,等.血浆蛋白质组中介分析揭示硒与肾功能间的因果关系及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(15):3661-3666.