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黄芩抑菌谱-效关系及数学模型研究中偏最小二乘回归分析法的应用分析

2020-08-06 711 上传者：管理员

摘要：以黄芩药材指纹图谱及其对金黄色葡萄球菌抑菌率为基础数据,采用偏最小二乘回归分析法(PLS)进行数据的谱-效相关性分析,并建立数学模型。结果表明,黄芩中有5个成分对抑菌率的影响较大,建立模型的药效预测值偏差在10%以内,能够较好地预测药效。该方法及所建立的数学模型能成为预测黄芩抑制金黄色葡萄球菌的药效作用的一种有效的手段。

关键词：
偏最小二乘回归分析法
数学教学
数学模型
谱-效关系
黄芩
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黄芩是临床常用中药,有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效,主要用于上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄疸等症。目前市场上黄芩野生品、不同生长年限的栽培品皆有,质量差别大,这对黄芩相关产品质量和临床使用效果有着直接的影响。近几年研究表明,除《中国药典》[1]规定的定量指标成分——黄芩苷以外,黄芩中的黄芩素、汉黄芩素等[2,3]也与其功效有关,是其主要特征成分。

对于多成分多指标的中药质量评价研究,目前使用较多的方法是谱-效相关分析[4],而合理的数据挖掘技术和处理方法的选择是谱-效相关分析中的重要部分[5]。现在,应用于该领域的数据分析处理方法有相关分析[6]、主成分分析[7]、灰色关联度分析[8]、神经网络[9]、偏最小二乘回归分析[10,11]等。这些分析方法各有特点和侧重,其中,偏最小二乘回归分析具有预测功能,适合在数据量小,甚至比变量维数还小,而相关性又比较大时使用。王艳辉等[12]采用该分析方法找到了不同产地穿心莲样品中4个与抑菌活性密切相关的化学成分,为建立其准确、可靠的质量评价方法提供了依据。

根据偏最小二乘回归分析法的适用范围和本研究的数据特点,拟采用该方法对黄芩抑菌作用的谱-效相关性进行研究,并建立数学模型,以探寻黄芩中各主要成分对其抑菌作用的贡献大小,并为完善黄芩谱-效相关质量综合评价系统提供数据支撑。

1、材料

1.1 仪器

电子天平(BP125D型,德国Sartorius);Milli-Q7000纯水机(美国Millipore);Waters2695高效液相色谱仪,Waters2996紫外检测器(美国Waters);WatersEmpower色谱工作站(美国Waters);SpectraMaxM5酶标仪(美国MolecularDevices);TA-2XJP型细菌浊度计(北京天安联合科技有限公司)。

1.2 材料

黄芩样品购自药店及饮片公司,经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴别为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根;葛根素对照品(批号:110752-200912)购自中国食品药品检定研究院;阿莫西林胶囊(产品批号:400170311)购自石药集团;胰酪大豆胨液体培养基(TSB,批号:20160106),购自青岛日水生物技术有限公司。

1.3 试剂配制

胰酪大豆胨液体培养基:称取胰酪大豆胨液体培养基干粉30g于1L蒸馏水中,微温溶解,分装,121℃高压灭菌15min,于4℃冰箱冷藏,备用。

1.4 数据

本研究所用的数据共10批,每批由11个数据组成,包括指纹图谱数据(前10个)和抑菌率值(最后1个)两部分。其中,指纹图谱数据来源于各黄芩样品的HPLC指纹图谱分析,是指纹图谱10个共有峰与内标物峰的比值(相对峰面积值)。

2、方法与结果

2.1 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件

采用WatersSymmetryC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相0.3%磷酸水溶液(A)-乙腈(C)梯度洗脱(0～30min,15%C,1.0mL/min;31～40min,25%C,0.8mL/min;41～70min,40%C,0.8mL/min;71～80min,40%C,0.8mL/min;81～90min,60%C,0.8mL/min;91～100min,70%C,0.8mL/min),柱温30℃,检测波长275nm,进样量10μL。

2.1.2 供试品溶液的制备

2.1.2.1 黄芩样品溶液的制备

从冰柜中取出黄芩粉末样品,放置至室温。采用四分法,按比例分别称取20～60目的黄芩粉末和过60目筛的黄芩粉末,共0.15g,精密加入60mL沸水,称定重量,置沸水浴中保温30min,每隔10min振摇一次,取出放至室温,用水补足减失的重量,摇匀,离心(转速2500r/min)15min,取上清液1mL,加水稀释至10mL,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液即得。

2.1.2.2 内标溶液的制备

取葛根素对照品适量,加水制成30μg/mL的对照品溶液。

2.1.2.3 供试品溶液的制备

精密量取黄芩样品续滤液与内标溶液各0.5mL,混匀,即得。

2.1.3 方法学考察

取2.1.2.3项下供试品溶液,按2.1.1项下条件连续进样6次,结果各共有峰与内标峰相对保留时间和相对峰面积值的相对标准偏差(RSD)均小于3.0%,表明仪器精密度良好。取同一供试液,在室温放置0、2、4、8、12h进样,测定指纹图谱,结果各共有峰与内标峰相对保留时间和相对峰面积值的RSD均小于3.0%,表明供试液在12h内稳定性良好。取同一批样品制备供试液,重复制备6份,测定,结果各共有峰与内标峰相对保留时间和相对峰面积值的RSD均小于3.0%,表明方法重复性良好。

2.1.4 指纹图谱的建立及色谱峰确定

对各样品进行测定,并将谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A版)建立黄芩HPLC对照指纹图谱,通过对照品比对和质谱分析,确定各色谱峰,见图1。

图1黄芩HPLC指纹图谱

Fig.1HPLCfingerprintofScutellariaeRadix

1—白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷;2—白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷;3—黄芩苷;4—黄芩苷异构体;5—5,7,8-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖酸苷;6—千层纸素-7-O-葡萄糖酸苷;7—汉黄芩苷;8—黄芩素;9—汉黄芩素;10—千层纸素A

2.2 体外抑菌实验

采用96孔板法对黄芩样品进行体外抑金黄色葡萄球菌试验。将2.1.2.1项下不同样品溶液的浓度调整至6.25mg/mL,每孔加入50μL液体培养基、50μL样品液和10μL调整浓度的金黄色葡萄球菌液,平行4次,另设空白组、阳性药物组(阿莫西林组)及菌液对照组,采用酶标仪测定96孔板的OD值,置于恒温恒湿培养箱内37℃培养18～24h后,分别测定其OD值,按式(1)计算抑菌率。

2.3 谱-效相关性分析

2.3.1 偏最小二乘回归分析方程的建立

本研究采用偏最小二乘回归分析法,对黄芩的体外抑制金黄色葡萄球菌作用效果进行分析,利用SIMCA14.0(Umetrics,瑞典)软件,选择黄芩样品的10个指纹图谱色谱峰的相对峰面积数据作为自变量X,其抑菌率值作为因变量Y,采用偏最小二乘回归分析方法进行谱-效相关关系分析,探讨指纹图谱与抑菌药效值数理关系,得到如下方程:

Y=0.092X1+0.616X2-0.277X3+0.08X4-0.05X5-0.142X6+0.135X7+0.295X8+0.248X9-0.167X10。

回归系数结果见表1、图2。其中,回归系数的正、负代表各成分对抑菌率值的正相关或负相关,回归系数绝对值越大,表明该自变量对抑菌率(药效)影响越大。

图2标准化回归系数

2.3.2 变量投影重要性分析

变量投影重要性(VIP)代表各成分对药效值的解释能力大小,其值越大说明该自变量对因变量的解释能力越强。VIP分析结果见表1、图3。

图3各成分VIP值

按照回归系数绝对值大小排序,可知各成分对抑菌率作用的影响由大到小依次为:成分2、成分8、成分3、成分9、成分10、成分6、成分7、成分1、成分4、成分5,且成分2、3、8、9、10的变量重要性值较大,在解释变量Y时具有显著重要性,该5种成分有可能是黄芩抗金黄色葡萄球菌的活性物质(群),分别为:白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(2)、黄芩苷(3)、黄芩素(8)、汉黄芩素(9)、千层纸素A(10)。

2.4 黄芩对金黄色葡萄球菌体外抑制作用的数学模型建立

应用偏最小二乘回归分析方法所建模型,得到了黄芩抑菌药效拟合值,计算拟合值与实验数据的相对误差,并使用Matlab2012a软件,对拟合数据与实验数据进行画图,其中x轴为实验数据,y轴为拟合数据,若两者相等,则绿色点分布在直线y=x上。结果显示,拟合数据与实验数据的平均相对误差为7.25%,由拟合图可以看出,绿色点在直线y=x周围均匀分布,该方法建立的数学模型的拟合值与实验值的拟合度较好,具体数据见图4和表2。

图4拟合图

3、讨论

将中药的药效作用与成分相关联是研究中药药效成分的一种方法,在明确药物各主要成分的前提下进行这种关联研究,使各成分对药效指标的贡献大小更加清晰,也能够更加透彻地解析该药物的药效物质基础。本研究在对黄芩样品主要色谱峰进行指认的基础上,采用偏最小二乘回归分析法进行谱效相关分析,得到了各主要成分对于抑菌作用的贡献大小,说明了黄芩抑制金黄色葡萄球菌作用是多成分协同作用的结果,揭示了黄芩抑菌作用的药效物质(群),提示在制定黄芩质量控制方法时,应考虑增加对药效作用贡献率较大的成分进行相关研究。

偏最小二乘回归分析方法将建模预测类型的数据分析与非模式的数据分析有机结合,具有拟合度高、预测能力强的优点。本方法建立的数学模型,可以初步预测抑菌药效值,其预测结果的误差较小,但仍有调整空间,下一步可以增大样本量,对模型进行修正,降低误差值,以期采用该方法实现对黄芩抑菌药效的准确预测。

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