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创建HIV-1整合酶耐药基因型检测技术

2020-06-30 369 上传者：管理员

摘要：目的随着整合酶抑制剂的使用，整合酶抑制剂耐药突变出现不可避免，为了更好地预防和控制艾滋病，根据中国1型艾滋病病毒(HIV-1)主要流行株建立HIV-1整合酶基因型耐药检测方法。方法根据国内HIV主要流行株(CRF01＿AE、B、CRF07＿BC、CRF08＿BC、C)参考序列，用Oligo软件在整合酶保守区设计引物。挑选160例不同病毒亚型、病毒载量> 1 000拷贝/mL的样本，进行巢式荧光定量聚合酶链反应核酸扩增和测序。拼接后的序列输入斯坦福大学耐药网站，进行耐药突变位点分析。结果成功扩增出HIV-1整合酶全长(288个氨基酸)，160个样品157个扩增成功(成功率为98.1%)。3名操作人员对15个样本进行扩增和测序，核苷酸序列一致性为(99.83±0.05)%。结论根据中国HIV-1主要流行株建立了整合酶耐药基因型检测方法，有助于优化艾滋病病人抗病毒治疗，有助于HIV-1的防控。

关键词：
1型艾滋病病毒
基因型
感染性疾病
整合酶耐药
检测方法
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艾滋病防控依然是一个重要的公共卫生问题[1]。由于高效、良好的耐受性和安全性，整合酶抑制剂（integrase strand transfer inhibitors,INSTIs）已成为抗反转录病毒治疗（ART）的重要组成部分[2]。在中国艾滋病诊疗指南（2018版）中，包含整合酶抑制剂的以下方案被推荐为一线治疗方案：两种核苷类反转录酶抑制剂骨架药物与艾生特（raltegravir,RAL）或特威凯（dolutegravir,DTG），单片合剂绥美凯（triumeq）或捷夫康（genvoya)[3]。拉替拉韦（raltegravir,RAL）和埃替拉韦（elvitegravir,EVG）耐药基因屏障相对较低，随着整合酶抑制剂的使用，整合酶抑制剂耐药突变出现不可避免[4]。耐药出现后，仍使用一线治疗的病人死亡风险明显高于转换至二线方案的病人，艾滋病病毒（HIV）耐药检测对艾滋病病人诊疗至关重要[5]。HIV-1亚型分布有地域性，为了优化艾滋病的治疗，本研究根据中国HIV-1主要流行株建立了HIV-1整合酶基因型检测方法。

1、材料与方法

1.1样本来源

血浆样本来自2016年在北京佑安医院就诊160名HIV-1感染者，所有HIV-1感染者的病毒载量均>1 000拷贝/mL，平均HIV-1病毒载量7 258.6拷贝/mL，无乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒合并感染、吸毒者和并发症。

1.2方法

将收集的血清样本进行蛋白酶和反转录酶基因型耐药分析，方法参考已发表文献[6]。

1)HIV-1病毒亚型和病毒载量测定：把蛋白酶和反转录酶基因序列输入斯坦福大学艾滋病病毒耐药数据库（https://hivdb.stanford.edu/）得到病人HIV-1亚型。使用雅培Abbott Real Time HIV-1测定仪检测HIV-1病毒载量。

2）引物设计：根据中国HIV-1主要流行株参考序列设计荧光定量聚合酶链反应（PCR）引物：CRF01＿AE(circulating recombinant forms,CRF),FJ441290(GenBank Accession Number);CRF07＿BC,AF286230;CRF08＿BC,AY008715;B’,DQ990880;B,K03455;C,AY967806。序列比对后，在整合酶区域内和周围最保守的区域设计引物，使用Oligo软件设计和分析引物。

3）整合酶序列扩增和测序使用QIAamp病毒核糖核酸（RNA）提取试剂盒（Qiagen,Duesseldorf,Germany）从140µL血浆样品中提取病毒RNA。使用HIV-1外侧引物（INT-OF:GCARGATTCRGGATYAGAAG,INT-OR:AAATGCCDGTCTCTTTCTCCTG），用一步反转录聚合酶链反应试剂盒（Ta Ka Ra Biotechnology，大连，中国）进行HIV int基因互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成和第一轮扩增，反应条件如下：50℃，30min;94℃变性2min；然后94℃30s、53℃45s、72℃2 min进行32个循环扩增，最后在72℃下延伸10min。用第一轮扩增产物和内侧引物（INT-IF:ATGGGTACCAGCACACAAAGG,INT-IR:CYCCTAGTGGGATGTGTACTTC）进行第二轮扩增，反应条件如下：94℃变性5min；然后94℃30s、53℃45s、72℃2min进行3个循环扩增，接着94℃30s、58℃45s、72℃2min进行27个循环扩增，最后在72℃下延伸5min。利用阴性对照来检测可能的污染。

扩增产物纯化后送北京博迈德基因技术有限公司测序，使用Contig Express和BioEdit等软件对测序片段拼接矫正，整理后的序列提交到斯坦福大学HIV耐药数据库进行耐药突变位点分析。

2、结果

本研究160名HIV-1感染病人病毒亚型、反转录酶和蛋白酶基因耐药等基本情况见表1。在160名入组病例中，15名HIV-1感染者携带主要的非核苷类反转录酶区基因突变：9名携带V179D,2名携带V179E,2名携带K103N,1名携带H221Y和1名携带H101E和E138A。

表1 160名未经治疗的HIV感染者基本信息及基因变异情况

HIV-1整合酶含有288个氨基酸，分子量为32KD，此研究设计的引物扩增的片段为1 071碱基对（base pair,bp）,包含整合酶基因全长（图1）。160个样本成功扩增和测序157例（成功率为98.1%）。3个扩增失败标本的病毒载量分别为1 039拷贝/mL、1 012拷贝/mL、1 104拷贝/mL。3名不同操作人员对15个样本进行扩增和测序，核苷酸序列一致性为（99.83±0.05)%(99.72%～100%）。

图1 HIV-1 int基因PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳

3、讨论

按照以往惯例，接受抗反转录病毒治疗后，首次出现抗HIV药物耐药病例报告需要3～5年时间[7]。目前，尚未推荐进行常规整合酶基因耐药检测，但整合酶基因耐药突变会随着整合酶抑制剂的广泛使用而出现[8]。

本研究在国内建立了整合酶基因型耐药检测方法。考虑到结合位点的遗传多样性，在设计的引物内引入简并碱基，提高了扩增效率。160例样本中，3个扩增失败标本的病毒载量分别为1 039拷贝/mL、1 012拷贝/mL、1 104拷贝/mL，将采用核酸富集等方法扩增低载量样本。

第一个整合酶抑制剂艾生特(raltegravir,RAL)在2007年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，Kristel Van Laethem等[9]建立了针对HIV-1 M组的整合酶基因型耐药检测方法，包括如下亚型：A,B,C,D,F,G,J,CRF01＿AE,CRF02＿AG,CRF03＿AB,CRF12＿BF,CRF13＿cpx。由于HIV-1的高度变异，不同的国家和地区HIV-1亚型分布不同，本研究建立的整合酶基因型耐药检测方法基于中国主要流行的HIV-1株。过去十多年，中国男男同性恋高危人群的艾滋病传播显著增加，CRF01＿AE是该人群主要流行的亚型[10]。根据HIV-1的env和gag区的序列，邵一鸣研究团队[11]前期得出的病毒亚型分布和本研究类似。为调查中国传播性耐药的发病率，2015年在全国范围内对5 627名新近确诊的HIV感染者中进行了横断面调查，共获得4 704个部分pol序列，根据部分pol序列得出的病毒亚型分布也和本研究类似[12]。由此可见，本研究选取的HIV-1亚型代表了中国目前主要的流行株。

欧洲和美国的两项研究未发现HIV-1原发整合酶耐药[13,14]。在中国，整合酶抑制剂属于自费药物，服用整合酶抑制剂药物的HIV-1感染病人较少，本研究尽管扩增出了整合酶基因全长，但未找到携带整合酶基因耐药突变的阳性对照。

总之，本研究在国内建立了HIV-1整合酶基因型耐药检测方法，将有利于优化HIV感染者的抗病毒治疗,有助于HIV-1的防控。

参考文献：

[1]中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心性病控制中心.2018年第3季度全国艾滋病性病疫情[J].中国艾滋病性病,2018,24(11):1075.

[3]中华医学会感染病学分会艾滋病丙肝学组，中国疾病预防与控制中心.中国艾滋病诊疗指南(2018版)[J].中国艾滋病性病,2018,24(12):1266-1282.

刘利锋,粟斌,姚均,李莉,安希钊,刘志英,代丽丽,孙丽君,张彤,吴昊.HIV-1整合酶耐药基因型检测方法的建立[J].中国艾滋病性病,2020,26(05):463-465.

基金: 国家“十三五”重大传染病防治科技重大专项(2017ZX10202102-005-003,2017ZX10202101-004-001,2018ZX10732101-001-012); 国家自然科学基金项目(81772165,81571973); 艾滋病研究北京市重点实验室(BZ008