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基于双硫死亡相关基因构建心力衰竭临床诊断模型的价值

2025-03-17 65 上传者：管理员

摘要：目的探究基于双硫死亡相关基因构建心力衰竭临床诊断模型的价值。方法获取训练集基因表达谱系列号(Gene Expression Omnibus Series, GSE)57345的差异表达双硫死亡相关基因，进行基因本体论(Gene Ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析、Metascape疾病富集分析。C57BL/6J雄性小鼠6只随机分为对照组和心力衰竭(heart failure, HF)组，每组3只，对照组给予生理盐水腹腔注射，HF组腹腔注射异丙肾上腺素。使用实时荧光定量聚合酶链反应检测关键基因的表达水平。结果GO富集分析主要涉及血小板聚集等方面；KEGG显著富集在紧密接头、血管平滑肌收缩等信号通路。Metascape富集分析显示，差异表达基因主要与局灶性肾小球硬化症、肾小球疾病、血小板疾病、肿瘤浸润、肾病综合征等疾病有关。HF组小鼠心体比表达明显高于对照组，心脏射血分数、短轴缩短率、心排血量、每搏量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。HF组小鼠心脏组织蛋白BNP、基因MYH10 mRNA表达明显高于对照组[1.026±0.501 vs 0.686±0.187,P=0.038;1.469(1.782,2.670)vs 0.360(0.786,1.117),P=0.000],心脏组织基因MYL6、TLN1 mRNA表达明显低于对照组，差异有统计学意义(0.575±0.105 vs 1.000±0.202,P=0.027;0.429±0.114 vs 1.000±0.109,P=0.000)。结论构建的心力衰竭诊断模型具有较好的诊断性能。

关键词：
HF
NT-proBNP
基因表达
心力衰竭
计算生物学
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心力衰竭(heartfailure,HF)病理生理过程的潜在生物标志物有助于临床进行早期诊断和管理,N末端B型钠尿肽前体(N-terminalpro-B-typenatriureticpeptide,NT-proBNP)在诊断和风险分层中的作用已得到证明,并可作为开始治疗的指南[1]｡近年来,提出了更多可能优于NT-proBNP的新型生物标志物｡例如,有学者通过生物信息学分析确定基质重塑关联蛋白5是驱动左心衰竭的关键生物标志物[2]｡最近的研究发现一种新型的细胞死亡形式,细胞内二硫键的积累会诱导应激反应,导致双硫死亡｡现阶段双硫死亡主要研究可能作为癌症治疗的新靶点[3]｡越来越多的研究表明,双硫死亡在多种疾病发展中起着关键作用,例如,心血管疾病､神经退行性疾病和肝脏疾病都与细胞双硫死亡密切相关[4]｡心肌细胞在葡萄糖匮乏的情况下,高表达的胱氨酸/谷氨酸反向转运体会促进细胞通过胱氨酸/谷氨酸交换,导致还原型辅酶Ⅱ耗竭和活性氧物质积累,最终引发心肌细胞死亡[5]｡此外,双硫死亡已被证明具有影响细胞免疫浸润的能力,HF发生后免疫系统被激活,为HF发病的免疫机制提供了新的见解[6]｡由于对双硫死亡的研究处于早期阶段,其对HF疾病进展的影响仍不确定｡因此,探索双硫死亡与HF病因之间的可能联系对于推进心血管疾病的治疗具有重要价值｡

1、材料和方法

1.1生物信息学分析在基因表达综合数据库中获得HF患者的基因表达芯片,训练集基因表达谱系列号(GeneExpressionOmnibusSeriesID,GSE)57345和验证集GSE29819｡使用R语言“Limma”包对训练集进行差异表达基因分析,将adj.P0.05作为筛选出差异表达基因的阈值｡通过文献检索获得双硫死亡相关基因[7]｡将训练集获得的差异基因与双硫死亡相关基因取交集,得到共同差异表达基因｡使用R软件相关数据包(“enrichplot”包､“clusterProfiler”包)对共同差异表达基因进行基因本体论(geneontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)富集分析,使用Metascape富集分析探究共同差异基因相对应的疾病情况｡使用LASSO回归和Logistic回归筛选出关键基因｡

1.2动物实验C57BL/6J小鼠6只,雄性,8~10周龄,购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司[SCXK(豫)2020-0005],随机分为对照组和HF组,每组3只,对照组给予生理盐水腹腔注射,HF组腹腔注射异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO,10mg/kg),1次/d,持续28d,最后1次注射后第2天行心脏超声心动图检测并取心脏组织用于后续实验[8-9]｡动物实验在石河子大学第一附属医院动物实验中心进行｡本研究得到石河子大学第一附属医院实验伦理委员会的批准(A2022-191-01)｡所有野生型小鼠均饲养于65%相对湿度､23℃室温的环境当中,并保持12h明暗交替特定病原体动物房条件下自由获得饮食,放置至少1周以适应环境｡

1.3超声心动图使用Vevo3100超声仪(FujifilmVisualsonics,加拿大)进行小鼠超声心动图检测,评估左心室收缩功能,每只小鼠记录3次,采集3个连续心动周期用于数据分析｡

1.4蛋白免疫印迹实验提取心脏组织总蛋白用于蛋白质印迹分析,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳分离,将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore公司,美国),将膜在5%脱脂牛奶中封闭2h,将膜与抗B型钠尿肽(brainnatriureticpeptide,BNP,Abcam公司,美国)的一抗孵育,在4℃下过夜,然后与辣根过氧化物酶二抗偶联的抗体(中杉金桥,中国)在室温下孵育2h｡使用化学发光检测仪器(Tanon,中国)获得印迹图像,使用ImageJ软件分析图像灰度值｡

1.5实时荧光定量聚合酶链反应(real-timefluorescentquantitativePCR,RT-qPCR)检测应用RT-qPCR检测相关基因肌球蛋白重链(Myosinheavychain,MYH)10､MYL6､踝蛋白1(Talin1,TLN1)在小鼠mRNA表达水平｡使用TotalRNAKit试剂盒(OmegaBio-tek,中国)提取总RNA｡使用逆转录试剂盒(ThermoFisherScientific,美国)将总RNA逆转录为cDNA｡使用UltraSYBRMixture试剂(CWBIO,中国)和LightCycler��96SW1.1的操作说明进行扩增(表1)｡以β肌动蛋白(beta-actin,β-actin)为内参,使用2-ΔΔCt方法对实验数据进行分析｡

表1RT-qPCR的引物序列

1.6统计学方法使用R4.2.1和GraphPadPrism9.5软件进行统计学分析｡计量资料服从正态分布的以x��±s表示,满足方差齐性检验的用t检验;非正态分布的计量资料服以M(Q1,Q3),采用非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1差异表达基因的初步筛选鉴定出差异表达基因10993个,将差异表达基因和双硫死亡相关基因取交集后获得8个共同差异表达基因,即MYH10､ACTB､MYL6､TLN1､戴帽蛋白肌Z系β(cappingactinproteinofmuscleZ-linesubunitbeta,CAPZB)､肌球蛋白重链9(myosinheavychain9,MYH9)､PDZ和LIM域蛋白1(PDZandLIMdomain1,PDLIM1)和CD2关联蛋白(CD2associatedprotein,CD2AP)｡基于共同差异基因进行GO和KEGG富集分析显示,GO富集分析主要涉及血小板聚集等方面;KEGG显著富集在紧密接头､血管平滑肌收缩等信号通路｡Metascape富集分析显示,差异表达基因主要与局灶性肾小球硬化症､肾小球疾病､血小板疾病､肿瘤浸润､肾病综合征等疾病有关(图1)｡

图1Metascape富集分析

2.2HF组和对照组小鼠心脏结构以及功能的比较HF组小鼠心体比表达明显高于对照组,心脏射血分数､短轴缩短率､心排血量以及每搏量明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,表2)｡

表2HF组和对照组小鼠心脏结构以及心功能的比较(x��±s,n=3)

2.3HF组和对照组小鼠关键基因表达比较HF组小鼠心脏组织蛋白BNP､基因MYH10mRNA表达明显高于对照组,心脏组织基因MYL6､TLN1mRNA表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,图2,表3)｡

图2蛋白BNP免疫印迹图

表3HF组和对照组小鼠关键基因表达比较(n=3)

3、讨论

本研究利用生物信息学方法鉴定出双硫死亡与HF相关的3个关键基因,即MYH10､MYL6和TLN1,这些关键基因的诊断性能得到数据集和体内实验的证实｡基因MYH10在疾病的表达明显高于对照组,而基因MYL6､TLN1在疾病的表达明显低于对照组,表明关键基因表达与疾病进展密切相关,这3个关键基因可能是HF新的治疗靶点｡

MYH10具有多种功能,包括调节胞质分裂､细胞运动和细胞极性,该基因的突变和心脏发育缺陷有关｡来自干细胞的细胞外囊泡在修复受损心脏组织和调节病理纤维化方面显示出良好的治疗潜力,有研究提出了一种来用于心脏修复的功能性膜状纳米囊泡[10]｡目前,MYL6的研究主要在成人肥胖与哮喘之间的共同遗传关联[11]｡通过检索国内外文献,尚未发现MYL6与HF的研究,这可能是未来研究的重点和方向｡TLN1可能参与细胞骨架结构与质膜的连接,既往研究表明,TLN1依赖性整合素活化是内皮增殖和产后血管生成所必需的[12]｡HF会激活免疫系统,终末分化的CD4+T细胞促进心肌炎症[13]｡巨噬细胞-NLR家族Pyrin域蛋白3活化促进肺动脉高压患者的右心室衰竭[14]｡M1和M2巨噬细胞亚群的特征已明确,M1巨噬细胞是促炎细胞,M2巨噬细胞具有抗炎作用,M1和M2巨噬细胞在HF过程中在不同条件下可以相互转化,两者之间的动态平衡与组织损伤和修复密切相关[15]｡因此,调节两种巨噬细胞之间的平衡对于治疗HF可能变得至关重要｡中性粒细胞作为心血管炎症的调节剂,中性粒细胞在脑卒中､HF､心肌梗死和新内膜形成的致病和修复过程中产生重要作用,因此,保持中性粒细胞的稳态至关重要[16]｡这些发现进一步支持了免疫细胞浸润和炎症在HF发展中的重要作用｡

总之,这项基于生物信息学分析和体内实验的研究揭示HF的关键基因,并且揭示了双硫死亡参与HF的发展,为HF的潜在病理过程和治疗策略提供了新的视角｡但关键基因在疾病发生过程中的作用机制研究尚不够深入,因此,后续可进行相关基础与临床研究,以明确关键基因在疾病中的作用机制｡

基金资助:兵团指导性科技计划项目(2023ZD001);团财政科技计划项目(2020AB023);

文章来源:李省,陈霞,杨沛垚,等.基于双硫死亡相关基因构建心力衰竭临床诊断模型的价值[J].中华老年心脑血管病杂志,2025,27(03):370-373.