缺氧缺血性脑病（hypoxia-ischemia encephalopathy,HIE）多见于新生儿，可导致神经系统损伤甚至死亡，致死率高达60%[1-2]。目前临床上对于HIE的有效治疗方法仍然有限，且限于HIE的早期治疗。因此，对HIE造成的脑部损伤的治疗成为了研究热点。木犀草苷是忍冬科植物金银花中的主要成分，属于黄酮类物质，可穿透血脑屏障，有抗病毒、抗炎症反应、抗氧化等药理活性[3-5]。研究显示，Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4）可激活核因子-κB(nuclear factorkappa B,NF-κB）信号通路并触发级联反应，而木犀草苷则可通过TLR4/NF-κB相关通路影响家禽肠道炎症和氧化应激[6]。TLR4/NF-κB信号通路与脑缺血损伤大鼠的神经功能密切相关[7-8]。然而，对于木犀草苷与HIE大鼠脑损伤及TLR4/NF-κB通路的相互作用目前尚不明确。因此，本研究拟探讨木犀草苷对HIE大鼠脑损伤及TLR4/NF-κB通路的影响，以期为临床提供参考。

1、材料与方法

1.1实验动物

60只7日龄雄性SD大鼠，体质量10～12 g，购自湖北贝恩特生物科技有限公司[使用许可证号：SYXK（鄂）2021-0119；生产许可证号：SCXK（鄂）2021-0027]。大鼠分笼饲养，饲养条件：湿度50%～65%，温度（20±2）℃，12 h光/暗循环，自由摄食饮水。本研究经本院动物伦理委员会批准（伦理批号：2208152）。

1.2试剂与仪器

木犀草苷（纯度>98%；批号：nkl-00090）购自江苏永健医药科技有限公司；TLR4激动剂脂多糖（lipopolysaccharide,LPS；批号：S1732-5mg）购自上海碧云天生物公司；脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF；批号：IPD20009R）、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis faction-α,TNF-α）检测试剂盒（批号：IPD20021R）购自湖北艾普蒂生物工程有限公司；TTC染色试剂盒（批号：8342）购自上海和序生物科技有限公司；RIPA裂解缓冲液（批号：89901）、化学发光底物ECL（批号：34579）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）试剂盒（批号：SP12914、SP30131）购自武汉赛培生物公司；兔源一抗TLR4（批号：LM870643R）、NF-κB（批号：LM860312R）、磷酸化的NF-κB(phosphorylated NF-κB,p-NF-κB；批号：LM3543R）购自上海联迈生物工程有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色试剂盒（批号：MB9898）购自大连美仑生物公司；兔源一抗活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved cysteine aspartate proteinase 3,Cleaved Caspase-3；批号：MAB835）购自安迪生物科技（上海）有限公司；β-actin（批号：IPD-ANM2224）及辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗（批号：GARTHRP-015）购自湖北艾普蒂生物工程有限公司。多功能酶标仪（型号：Varioskan LUX）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；光学显微镜（型号：IX73）购自南京瞭望光电技术有限公司。

1.3 HIE大鼠模型的构建及分组

将其中48只大鼠随机分为模型组、低剂量组、高剂量组、高剂量+LPS组，每组12只。根据文献[9]构建HIE大鼠模型。用乙醚麻醉大鼠，固定并暴露颈部，切开并暴露左侧颈总动脉，结扎后缝合。1 h后将大鼠放入含8%氧气和92%氮气的密闭环境中使之缺氧，2 h后评估模型构建情况，Longa评分为2～3分则表示建模成功。剩余12只大鼠仅暴露颈总动脉，不予结扎且不进行缺氧处理，作为正常对照（normal control,NC）组。造模后，低剂量组、高剂量组大鼠分别以25 mg/kg、50 mg/kg木犀草苷进行腹腔注射[10]，高剂量+LPS组大鼠腹腔注射50 mg/kg木犀草苷和0.5 mg/kg TLR4激动剂LPS[11],NC组、模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，每天1次，连续3 d。

1.4神经功能缺损评分（neurological severity score,NSS）评估脑部神经功能

药物干预3 d后，采用NSS评估大鼠脑神经功能[12]：神经功能正常，0分；轻度神经功能缺损（提尾时左前肢屈曲），1分；中度神经功能缺损（行走时向左侧转圈），2分；重度神经功能缺损（行走时向左侧转圈），3分；无法自主行走，意识减退，4分。

1.5 ELISA法检测血清BDNF、TNF-α水平

NSS结束后，收集每组大鼠主动脉血，3 000 r/min离心10 min得到血清，按照ELISA试剂盒说明书分别检测血清BDNF、TNF-α水平。用多功能酶标仪检测光密度（optical density,OD）值。

1.6 HE染色检测脑组织病理变化

血液收集完成后，每组随机处死6只大鼠，收集脑组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋。然后取脑组织的海马区行冠状位切成5µm薄片，常规脱蜡、水合后，将脑部切片用HE溶液染色，用光学显微镜对脑部海马区组织进行病理学观察。

1.7试剂盒检测脑组织氧化应激指标SOD、MDA水平

血液收集完成后，取每组剩余6只大鼠脑部组织，剪碎后加入裂解液进行匀浆，一部分匀浆以10 000 g离心10 min取上清液。按照试剂盒说明书检测脑组织匀浆SOD、MDA水平。剩余脑组织匀浆于-80℃冷冻保存。

1.8 TTC染色检测脑梗死情况

选取25只大鼠，根据1.3重新进行饲养、HIE造模及分组干预，每组5只，给药结束后收集其脑组织，处理、切片，用2%的TTC溶液进行染色，在37℃下避光孵育15 min。最后观察记录脑组织切片，并计算脑梗死体积比（白色区域为梗死组织）。

1.9 Western blot检测脑组织TLR4、NF-κB、p-NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达

取1.7中剩余脑组织匀浆，用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白样品，依次将蛋白进行定量，10%的SDS-PAGE分离，转至PVDF膜，封闭，然后将其与一抗TLR4(1∶1 000）、NF-κB(1∶1 000）、p-NF-κB(1∶1 000）、Cleaved Caspase-3(1∶1 000）、β-actin(1∶1 000）在4°C下孵育过夜，次日，膜与二抗室温孵育2 h，洗膜。加入ECL显色试剂检测蛋白质成像，用Image J软件分析蛋白水平。

1.10统计分析

使用SPSS 25.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示。数据若符合正态分布和方差齐性，用单因素方差分析比较多组间差异，进一步两组间比较行Tukey检验；若不符合正态分布和方差齐性，则用Kruskal-Wallis H秩和检验比较多组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠NSS比较

与NC组大鼠比较，模型组大鼠NSS升高（P<0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组大鼠NSS降低（P<0.05）；与高剂量组比较，高剂量+LPS组大鼠NSS升高（P<0.05），见图1。

图1各组大鼠NSS比较

*：与NC组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与低剂量组比较，P<0.05；▲：与高剂量组比较，P<0.05

2.2各组大鼠血清TNF-α、BDNF水平比较

与NC组比较，模型组大鼠TNF-α水平增加（P<0.05),BDNF水平下降（P<0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组大鼠TNF-α水平下降（P<0.05),BDNF水平增加（P<0.05）；与高剂量组比较，高剂量+LPS组大鼠TNF-α水平增加（P<0.05),BDNF水平下降（P<0.05），见图2。

图2各组大鼠血清BDNF、TNF-α水平比较

a:BDNF水平；b:TNF-α水平*：与NC组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与低剂量组比较，P<0.05；▲：与高剂量组比较，P<0.05

2.3各组大鼠脑组织病理损伤观察

NC组大鼠脑部海马区组织神经细胞结构清晰，排列有序整齐，数目正常无损伤；模型组大鼠脑部海马区组织结构紊乱，神经细胞数量明显减少，间隙加大，核固缩，细胞出现坏死；与模型组比较，低剂量组大鼠脑部海马区组织病理损伤有些许改善，高剂量组大鼠脑部海马区组织病理损伤明显减轻，结构逐渐清晰，神经细胞数量正常；与高剂量组比较，高剂量+LPS组大鼠脑部海马区组织病理损伤则加重，见图3。

2.4各组大鼠脑部氧化应激水平比较

与NC组比较，模型组大鼠SOD水平下降（P<0.05),MDA水平增加（P<0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组大鼠SOD水平增加（P<0.05),MDA水平下降（P<0.05）；与高剂量组比较，高剂量+LPS组大鼠SOD水平下降（P<0.05),MDA水平增高（P<0.05），见图4。

图3 HE染色检测脑组织病理变化（×400)

图4各组大鼠脑组织中SOD、MDA比较

2.5各组大鼠脑梗死体积比较

与NC组比较，模型组大鼠脑梗死体积增加（P<0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组大鼠脑梗死体积减少（P<0.05）；与高剂量组比较，高剂量+LPS组大鼠脑梗死体积增加（P<0.05），见图5、6。

2.6各组大鼠脑组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达比较

与NC组比较，模型组大鼠TLR4、p-NF-κB/NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组大鼠TLR4、p-NF-κB/NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达降低（P<0.05）；与高剂量组比较，高剂量+LPS组大鼠TLR4、p-NF-κB/NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高（P<0.05），见图7。

3、讨论

HIE是由大脑缺氧以及血液供应不足引起，与氧化应激、炎症、细胞凋亡等有关，其中炎症是HIE的关键[13-15]。HIE模型构建通常采用颈总动脉结扎以及缺氧的方法，本研究利用上述方法构建HIE大鼠模型，结果显示，造模大鼠NSS升高，表明HIE大鼠脑部神经受损。由于炎症以及氧化应激相关反应与HIE密切相关，因此HIE大鼠的炎症因子以及抗氧化能力会表现异常。BDNF、TNF-α与炎症相关，而SOD和MDA作为评估氧化应激常用的指标，在HIE大鼠中同样发生变化，且大鼠脑部出现明显的脑梗死现象。本研究结果显示，模型组大鼠海马组织病理损伤严重，血清BDNF水平及脑组织SOD水平均降低，TNF-α水平及MDA水平升高，脑梗死体积明显增加，表明HIE大鼠脑部受损，HIE大鼠造模成功。

图5各组大鼠脑梗死体积比较

*：与NC组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与低剂量组比较，P<0.05；▲：与高剂量组比较，P<0.05

木犀草苷在金银花、菊花、青兰、鸡眼草、忍冬等中草药中广泛存在，其中金银花、菊花、锦灯笼是以木犀草苷含量为质控的中药材。在薏苡附子败酱散中，木犀草苷可通过调节抗炎信号和TLR4/NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用[16]；木犀草苷外周给药时可穿透血脑屏障，对脑损伤引发的神经损伤有保护作用，可对抗缺血和再灌注损伤，减少梗死[17]。本研究结果显示，低、高剂量的木犀草苷治疗HIE大鼠均可减轻海马组织病理损伤，降低炎症因子水平和脑梗死体积，抑制氧化应激，且高剂量效果更显著。表明木犀草苷可以改善HIE大鼠脑损伤，减轻炎症反应与氧化应激反应。提示木犀草苷可能是治疗HIE的潜在药物。

图6 TTC染色检测大鼠脑梗死情况

图7各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB、p-NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达比较

a:Western blot检测蛋白表达；b：蛋白相对表达水平*：与NC组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与低剂量组比较，P<0.05；▲：与高剂量组比较，P<0.05

有研究显示，首荟通便胶囊中含有木犀草苷成分，其可抑制TLR4/NF-κB信号通路从而减少促炎细胞，缓解炎症[18]。TLR4/NF-κB信号通路参与炎症反应的调控，并与细胞凋亡有关，而且TLR4/NF-κB通路的抑制可改善脑缺血再灌注大鼠脑部损伤，并减轻肠道炎症[19-21]。本研究结果显示，HIE大鼠脑组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高，说明TLR4/NF-κB通路在HIE进展中处于激活状态[22]。低、高剂量木犀草苷治疗可降低HIE大鼠脑组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达，且对TLR4、p-NF-κB/NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达的抑制作用随木犀草苷浓度的增加而增强，这与木犀草苷对脓毒症小鼠TLR4/NF-κB通路的抑制作用一致[23]，说明木犀草苷在不同疾病中对TLR4/NF-κB通路的作用是相同的。而TLR4/NF-κB通路激活剂LPS减弱了高剂量木犀草苷对HIE大鼠脑组织氧化应激、脑损伤的抑制作用，证实了木犀草苷可能通过抑制TLR4/NF-κB通路改善HIE大鼠脑损伤，减轻炎症与氧化应激反应。

综上所述，木犀草苷可改善HIE大鼠脑损伤并抑制TLR4/NF-κB通路，且TLR4/NF-κB通路的下调可能是木犀草苷改善脑损伤的作用机制。然而本研究尚存在不足之处，木犀草苷对HIE大鼠脑损伤的影响测定检验相对较少，并且对于相关TLR4/NF-κB通路的研究较浅，后续将增加实验深入探究木犀草苷改善HIE的作用机制。

参考文献:

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[5]吕蕊,徐文.金银花不同花期有机酸､木犀草苷､花青素与抗氧化活性关系[J].分子植物育种,2021,19(22):7579-7587.

[9]张赟,李珂,补王珍.电针调控Nrf2/HO-1通路对缺血缺氧性脑损伤大鼠小胶质细胞活化的影响[J].天津医药,2023,51(2):149-154.

[10]王明鹤,杨峰,常成,等.木犀草素对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的神经保护作用[J].中国病理生理杂志,2022,38(6):993-1000.

[11]李晓蕾,朱海生,麻瑞娟,等.基于TLR4/NF-κB通路探讨藏红花素对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用[J].康复学报,2022,32(6):518-526.

基金资助:武汉市中医药科研项目(WZ22C65);

文章来源:杨畅,金海涛,张雯.木犀草苷对缺氧缺血性脑病大鼠脑损伤的影响及机制[J].局解手术学杂志,2024,33(12):1033-1038.