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食物中的铁在改善雄性小鼠低氧性肺动脉高压心室重构中的作用

2024-09-23 78 上传者：管理员

摘要：目的探究食物中的铁在改善雄性小鼠低氧性肺动脉高压（HPH）心室重构中的作用。方法将雄性小鼠随机分为常氧对照组（暴露于海拔为2 260 m的环境中）、低氧对照组（暴露于模拟海拔为5 000 m的低压氧舱）、低氧高铁组（暴露于模拟海拔为5 000 m的低压氧舱），每组10只。采用右心导管插入术测量右心室收缩压（RVSP），采用相关公式计算右心室肥厚指数（RVHI），采用HE染色法观察心室组织及肺小动脉的变化并计算血管壁面积占血管总面积的百分比（WA%）和血管壁厚度占血管直径的百分比（WT%），采用Western Blot法测定右心室组织中肉毒碱棕榈酰基转移酶1(carnitine palmitic acyltransferase,CPT1A)、铁蛋白（ferritin,FTN）、转铁蛋白受体（transferrin receptor,TFR）、膜转铁蛋白（ferroportin,FPN）含量，采用UPLC-Orbitrap质谱系统的非靶向组学分析法对常氧对照组、低氧对照组、低氧高铁组小鼠的心室作组学分析。结果与常氧对照组比较，低氧对照组的RVSP、RVHI和WA%、WT%均升高（P<0.05）;FPN蛋白表达水平降低（P<0.05）,TFR、FTN、CPT1A蛋白表达水平无统计学差异；心室肌细胞排列紊乱，纤维化更明显。与低氧对照组比较，低氧高铁组小鼠的RVSP、RVHI和WA%、WT%明显下降（P<0.05）,FPN蛋白表达水平升高（P<0.05）,TFR、FTN、CPT1A蛋白表达无统计学差异；心室肌纤维化程度减轻。与常氧对照组比较，低氧对照组小鼠右心室组织中绝大部分肉碱衍生物及中、长链脂肪酸代谢水平无明显变化；低氧高铁组中绝大部分肉碱衍生物及中、长链脂肪酸代谢水平降低，尤其是不饱和脂肪酸。结论可能通过食物中的铁增强心肌脂肪酸氧化能力而改善HPH心室重构。

关键词：
PAP
pH
低氧
肺动脉高压
静息时肺动脉压
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临床将肺动脉高压（PH）定义为静息时肺动脉压（PAP）异常升高。低氧性肺动脉高压（HPH）是PH的常见类型，由于右心衰等症状出现较晚，使得患者进行临床治疗时病情已到中晚期。目前治疗HPH的药物不能预防或逆转疾病，所以亟需研发新的诊断和治疗方法。近期的研究发现[1]，铁的代谢紊乱是肺血管疾病的早期表现，HPH患者中存在较多的铁缺乏症。Willie等学者[2]将平原人及适应高原的夏尔巴人转移到海拔5 050 m时发现，肺动脉收缩压升高并伴随铁代谢指标改变，主要表现为血清铁、铁蛋白、铁调素和总铁结合力及转铁蛋白饱和度均降低，这种改变在平原人群更为明显。Ghosh等学者[3]发现，缺失铁调节蛋白1的大鼠出现PH，伴组织铁缺乏。Jiang Y等学者[4]发现，在慢性低氧诱导的HPH大鼠模型中也会出现血清铁水平明显降低的现象。所以对这一机制的理解，可以让我们拿出预防、抑制甚至逆转疾病的更多有效措施。本研究通过建立雄性小鼠PH模型，探究食物中的铁在改善雄性小鼠HPH心室重构中的作用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

将SPF级雄性C57BL/6小鼠[6周龄～8周龄，体质量20 g～24 g，购自斯贝福（生物）生物技术有限公司，动物合格证：SCXK（京）2019-0010]分为常氧对照组（暴露于海拔为2 260 m的环境中。C组，n=10）、低氧对照组（暴露于海拔为5 000 m的低压氧舱。H组，n=10）、低氧高铁组[暴露于海拔为5 000 m的低压氧舱。饲料（铁含量：2 000 mg/kg）购自中国博奥派克公司。H+HID组，n=10]。本研究经青海大学附属医院伦理委员会批准（批准号：P-SL-2022-056）。

1.1.2 试剂与仪器

蛋白预染Marker、RIPA缓冲液，BCA蛋白检测试剂盒，ECL化学发光试剂购自美国Thermo Fisher公司；用CPT1A、β-actin、HRP标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG购自武汉三鹰有限公司；FTN、TFR购自美国Ab-cam公司；FPN抗体购自美国Novus Biologicals公司；PVDF膜购自德国Millipore公司。

电泳仪、电泳槽购自美国Bio Rad公司；低压低氧氧舱（DYC-3000）购自中航风雷公司；漩涡混合器（QL-901）购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电热恒温培养箱（DHG-9030A）购自上海精宏试验设备有限公司；Powerlab生物信号采集系统（SPR-671）购自上海赞德医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组

将小鼠适应性饲养7 d，建立HPH小鼠模型：将低氧对照组、低氧高铁组小鼠置低压氧舱（O2浓度为10%)28 d，将常氧对照组置海拔为2 260 m的西宁地区28 d。

1.2.2 实验动物处理

喂养28 d后麻醉[于小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）]并固定小鼠，分离右颈外静脉并结扎，在右颈外静脉切口并缓慢插入连接生物信号采集仪的聚乙烯导管（PE-10管，0.21 mm），测量RVSP。小鼠测压结束后，开胸取心、肺组织，用PBS液冲洗干净，将收集的左肺组织固定在4%多聚甲醛中，其余组织置冰箱（-80℃）。沿室间隔将心室分离右心室（RV）和左心室加室间隔（LV+S），用滤纸吸去分割组织上多余水分，精确称量组织干重，计算右心肥厚指数（RVHI):RV/（LV+S）。

1.2.3 小鼠心、肺组织形态学观察

将心室心肌及肺组织以常规方法制片，在显微镜（20×）下观察。用Image J软件计算肺小动脉WA%、WT%。

1.2.4 蛋白表达水平检测

用蛋白质印迹（Western Blot,WB）法检测蛋白表达水平。将小鼠心脏组织剪碎并在冰上研磨，收集组织于离心管内，加入适量的RIPA裂解液，经组织匀浆和超声处理后，置冰上继续裂解直至裂解完全后离心（4℃，12 000 r/min,20 min）取上清液。采用BCA蛋白浓度检测法进行总蛋白定量。取40μg总蛋白，以电泳（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶）方式分离蛋白，用三明治法转膜2 h，将蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜浸泡于5%脱脂牛奶（1×TBST缓冲液配制）封闭（2 h，室温）。用CPT1A抗体（1∶1000）、TFR抗体（1∶1000）、FTN抗体（1∶1000）、FPN抗体（1∶1000）、β-actin抗体（1∶1000）孵育（4℃，过夜）。回收抗体洗膜后，将膜与用HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗（1∶2000）在37℃下孵育2 h，再次洗膜。将发光液A和发光液B等量混匀，在PVDF膜上滴加适量的ECL发光试剂，1 min后用全自动化学发光分析仪进行蛋白水平检测。采用Image J软件做蛋白条带强度定量。

1.2.5 小鼠心脏组织的收集与制备

用PBS清洗右心室的血液和污染物后，迅速剥离脂肪和结缔组织并清洗干净。用组织剪将右心室组织分离成1 cm3左右的小块保存（液氮）。

1.2.6 色谱与质谱条件设定

色谱条件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.8μm）进行液相色谱分离。流动相A:0.1%FA水，流动相B:100%乙腈；流速：0.3 mL/min；洗脱梯度：2 min内的缓冲液B浓度为0%,4 min内梯度线性上升至48%,8 min内梯度上升至100%并保持2 min,0.5 min内梯度下降至缓冲液B浓度为0%，再平衡3 min。

质谱条件：喷雾电压为3.8kv（+）和3.2kv(-);Capillary Temperature为320℃；Sheath Gas为30arb;Aux Gas为5 arb;Probe Heater Temp为350℃；S-Lens为50。质量扫描范围为70 m/z～1050 m/z。

1.2.7 代谢组学数据处理与分析

通过Analyst TF 1.7.1软件采集代谢组学的原始数据。采用PeakView 2.2软件、MarkerView 1.3.1软件处理数据。采用HMDB数据库确定潜在的生物标志物。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS25.0软件进行统计学分析，实验结果以均数±标准差表示。数据表现为正态分布时，多组间比较采用单因素方差分析法，数据表现为非正态分布时，采用秩和检验法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 小鼠一般情况评估

第1天的常氧对照组、低氧对照组、低氧高铁组差异无统计学意义；暴露低氧7天以后，常氧对照组体质量平稳增长，由第1天的21.04±0.60增长到第28天的23.80±1.44；相比常氧对照组，低氧对照组小鼠体质量增长减慢（P<0.05）；相比常氧对照组和低氧对照组，低氧高铁组体质量下降（P<0.05）。（表1，图1)

2.2 各组RVSP与RVHI对比

与常氧对照组比较，低氧对照组的RVSP、RVHI升高（P<0.05），而低氧高铁组的升高不明显。（表2)

表1体重/g,

图1 体质量变化趋势/,n=10

表2各组小鼠的RVSP、RVHI/

2.3 各组小鼠右心重构观测

与常氧对照组相比，低氧对照组右心室的心肌细胞排列紊乱，心肌纤维增粗，部分心肌细胞胞核增大，心肌细胞间质增加；而低氧高铁组较低氧对照组有所减轻（图2）。

图2 各组小鼠右心室病理形态/A:1×；B:20×

2.4 各组小鼠肺动脉重构观测

与常氧对照组比较，低氧对照组肺动脉血管壁增厚（P<0.05）、WT/TT增高（P<0.05），管腔狭窄（P<0.05）、WA/TA增高（P<0.05）；而与低氧对照组相比，低氧高铁组血管壁变薄（P<0.05),WT/TT降低（P<0.05），管腔狭窄程度减轻（P<0.05),WA/TA降低（P<0.05）。（图3，表3)

图3 各组小鼠肺动脉病理结果/HE,20×

表3各组小鼠的WA/TA和WT/TT/

2.5 各组小鼠右心组织中的TFR、FTN、FPN、CPT1A表达比较

在右心组织中，常氧对照组、低氧对照组、低氧高铁组的TFR、FTN、CPT1A蛋白表达水平无统计学差异；而与常氧对照组比较，低氧对照组的FPN蛋白表达水平降低（P<0.05），与低氧对照组比较，低氧高铁组的FPN蛋白表达水平升高（P<0.05）。（图4，表4)

图4 心肌组织内的FPN、TFR、FTH和CPT1A表达图/

表4心肌组织内的FPN、TFR、FTH和CPT1A蛋白表达水平/

2.6 心肌脂质代谢标志物检测

通过UPLC-Orbitrap质谱系统的非靶向脂质组学分析平台对三组小鼠进行了心脏脂质代谢标志物鉴定，其中包括16种肉碱衍生物、15种脂肪酸。与常氧对照组相比，低氧对照组中的绝大部分肉碱衍生物及中、长链脂肪酸代谢水平无明显变化；而在低氧高铁组中，绝大部分肉碱衍生物及中、长链脂肪酸代谢水平显著（Fold Change>1,FC>1）降低，特别是不饱和脂肪酸下降更为明显，提示脂肪酸氧化能力增强，而且多不饱和脂肪酸的氧化水平显著增强，减少了游离不饱和脂肪酸的含量。（表5，表6)

表5三组小鼠心脏肉碱代谢结果/m·Z-1,

表6三组小鼠心脏脂肪酸代谢结果/m·Z-1,

3、讨论

右心室功能障碍在PH患者中更为明显，也是终末期HPH的一个显著特征。目前人体和动物实验结果已经表明，铁稳态影响肺血管对低氧的反应及肺血管重构，而铁的替代治疗可显著减轻低氧诱导的HPH[5,6]。因此，本研究通过给予饮食铁来探索临床治疗HPH的更多可能性。

生理状态下心肌细胞在氧气充足的情况下主要依靠线粒体氧化磷酸化供能，而线粒体氧化磷酸化的底物大部分则来源于脂肪酸代谢中间产物[7]。然而在高海拔地区，由于特殊的低压低氧生态环境，对心脏这种高耗能的组织输送氧气不足，表现出线粒体呼吸抑制和ATP产生减少[8]，而先前的研究显示，这种线粒体呼吸抑制的原因可能是由于脂肪酸氧化受抑制[9]。作为氧气运输所必需的元素，铁一方面是携带氧气的蛋白质，另一方面也是氧化还原酶的组成部分，影响机体的氧化还原状态。本研究通过心脏脂质代谢组学研究发现，常氧对照组和低氧对照组脂肪酸代谢产物的差异无统计学意义，这可能因常氧组饲养在中海拔地区所致。而在低氧下，高铁饮食可以降低绝大部分肉碱衍生物及中、长链脂肪酸代谢水平，尤其是不饱和脂肪酸水平，表明食物中的铁可能通过增强心肌细胞中、长链脂肪中的脂肪酸氧化能力，缓解了低氧下与HPH相关的右心室肥厚的发生。

综上所述，本研究通过造模，在明确了慢性持续性低氧时高铁饮食可能缓解HPH的基础上，采用脂质代谢组学技术阐明了铁对低氧性HPH小鼠心脏脂质代谢的影响，发现了铁可能通过增强心肌脂肪酸氧化能力而减缓了右心重构。本研究结果为研究低氧性HPH的机制提供了更多参考。

基金资助:高原医学教育部重点实验室资助项目(编号:2023-KF-2);

文章来源:王慧杰,耿玉梅,李文颖,等.食物中的铁在改善雄性小鼠低氧性肺动脉高压心室重构中的作用[J].中国高原医学与生物学杂志,2024,45(04):255-262+270.