PM2.5指空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒物，主要来源于机动车尾气、燃煤、扬尘和香烟烟雾等，是空气中的主要污染物之一。流行病学研究显示PM2.5的暴露是多种心血管疾病的危险因素[1-2],可能的作用机制包括氧化应激和炎性反应等[3-4]。内皮细胞损伤是许多心血管疾病的始动因素，PM2.5可能正是通过氧化应激和炎性反应两大途径引起内皮细胞损伤进而导致多种心血管疾病的发生和发展，但其具体的分子机制目前尚未完全阐明。炎症小体由胞质传感器NOD样受体(NLRs)家族蛋白，适配器凋亡相关微粒蛋白(ASC)和效应器半胱氨酸天冬氨酸酶-1前体(pro-caspase-1)组成，包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIm2等[5]。NLRP3炎症小体是研究得最广泛的炎症小体，由NLRP3蛋白、ASC和pro-caspase-1组成。NLRP3炎症小体可被多种外源性病原体相关分子模式(PAMPs)和内源性损伤相关分子模式(DAMPs)激活，剪切pro-caspase-1形成有活性的caspase-1,后者进一步剪切pro-IL-1β和pro-IL-18,形成成熟的IL-1β和IL-18,参与多种疾病的病理过程[6]。研究显示PM2.5可诱导NLRP3活化而引起心、肺功能障碍，导致多种心血管和呼吸系统疾病的发生发展[7],但其确切的分子机制仍有待深入研究。本研究以人主动脉内皮细胞(HAECs)为研究对象，建立PM2.5诱导的内皮细胞损伤模型，观察PM2.5对HAECs细胞活力和凋亡的影响，探讨NLRP3炎症小体信号通路在PM2.5致HAECs细胞损伤中的作用机制，为临床上预防和治疗心血管疾病提供相应的理论依据。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

NLRP3、IL-1β、caspase-1、Bax和Bcl-2抗体(Abcam);Mito-TEMPO(Sigma);NAC、MTT、ELISA试剂盒、DAPI染色液、MDA检测试剂盒、LDH检测试剂盒、ROS检测试剂盒、PrimeScript RT reagent kit和SYBR Green qPCR mix(碧云天);mtROS检测试剂盒(贝博生物)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染：

HAECs细胞购买自深圳华拓生物科技有限公司(HT-X2397),采用内皮细胞完全培养基(89%DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素),于5%CO2、37℃培养箱中培养，2 d更换1次培养基，细胞长至80%融合时，进行消化传代，取3～5代细胞进行实验。按照Lipofectamine 2000说明书要求转染siRNA。

1.2.2 PM2.5的采集与制备：

参照空气质量指数和PM2.5监测数据，选择PM2.5严重超标的雾霾天气进行采样。采样前将滤膜展平用锡箔纸包好，200 ℃高温处理2 h, 冷却后放入干燥器中平衡24 h。在采样点安置中流量采样器，采样时间为24 h, 连续采样3 d。采样结束后，取出滤膜，用陶瓷剪刀剪碎，放入超声振荡器中洗脱滤膜上的颗粒物，收集洗脱液后过滤，用真空冷冻干燥机干燥成干粉，加入无菌PBS液配制成50 mg/mL的染毒母液，-80 ℃避光保存备用。染毒前超声振荡母液使颗粒物充分混匀，用培养基稀释成50、200和400 μg/mL的混悬液备用。

1.2.3 细胞分组及处理：

将培养好的HAECs细胞分为正常对照组和PM2.5低、中、高浓度染毒组。正常对照组用完全培养基培养；低、中、高浓度染毒组分别用50、200、400 μg/mL的PM2.5混悬液染毒培养。每组实验设置三复孔。染毒培养12 h和24 h后分别进行相应的检测。

1.2.4 MMT法检测细胞活力：

将培养至80%融合的HAECs细胞消化后以1×104/孔浓度接种到96孔板，培养24 h后PM2.5染毒24 h, 然后每孔加入20 μL的MTT溶液(5 g/L),孵育4 h后弃培养液，再加入150 μL的DMSO,低速振荡10 min, 用酶标仪读取490 nm处OD值。每组设三复孔，重复3次实验，取平均值比较各组细胞活力。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡：

将HAECs细胞接种到6孔板，培养24 h后PM2.5染毒24 h, 收集细胞，PBS漂洗3遍，PI染色，流式细胞仪上机检测。每组设三复孔，重复3次实验，取平均值计算凋亡率。

1.2.6 DAPI染色观察细胞凋亡：

将HAECs细胞接种到铺有盖玻片的6孔板，培养24 h后PM2.5染毒24 h, PBS漂洗3次，95%乙醇室温固定30 min, PBS漂洗3次，加入DAPI工作液，室温避光孵育15 min, 取出盖玻片，倒扣在载玻片上，置荧光显微镜下观察。

1.2.7 ELISA法检测IL-1β和IL-18的含量：

4组细胞经相应处理后，收集培养上清，2 500 r/min、4 ℃离心20 min, 收集上清，按照ELISA试剂盒说明书要求操作，检测IL-1β和IL-18的含量。

1.2.8 MDA和LDH含量的检测：

4组细胞经相应处理后，分别收集细胞和培养基上清，PBS洗涤细胞后制备成混悬液，超声破碎细胞，用硫代巴比妥法检测MDA含量；对于培养基上清，用比色法检测LDH活性。操作步骤均按照试剂盒说明书进行。

1.2.9 ROS和mtROS的检测：

4组细胞经相应处理后，弃培养基，按照试剂盒说明书操作，检测细胞内ROS和线粒体ROS的数值。

1.2.10 Western blot:

4组细胞经相应处理后，离心收集细胞，利用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行定量。10%SDS-PAGE胶电泳分离蛋白质，每个泳道上样40 μg, 然后转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h, 一抗4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，5 min/次。二抗室温孵育1 h, TBST漂洗3次，5 min/次，ECL化学发光法扫描成像。

1.2.11 Q-PCR:

4组细胞经相应处理后，弃培养基，用Trizol提取总RNA,反转录合成cDNAs, 采用SYBR Green法进行荧光定量PCR。采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

1.3 统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件，计量资料以

表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PM2.5对HAECs的细胞毒性作用

2.1.1 与对照组比较，PM2.5染毒12h,只有高浓度(400μg/mL)能够显著降低HAECs细胞活力，细胞活力只有对照组的67.83%(P<0.01);而PM2.5染毒24h,中浓度(200μg/mL)和高浓度(400μg/mL)均可明显降低HAECs细胞活力，细胞活力分别是对照组的68.00%和40.17%(P<0.01)。见表1。

2.1.2 与对照组比较，PM2.5染毒12h,只有高浓度(400μg/mL)能够显著提高HAECs细胞释放LDH,是对照组的 1.97倍(P<0.01);而PM2.5染毒24h,中浓度(200μg/mL)和高浓度(400μg/mL)均可明显提高HAECs细胞释放LDH,分别是对照组的1.92和2.51倍(P<0.01)。见表1。

2.1.3 与对照组比较，PM2.5染毒12h,只有高浓度(400μg/mL)能够显著增加HAECs细胞的MDA含量，比对照组增加2.79倍(P<0.01);而PM2.5染毒24h,中浓度(200μg/mL)和高浓度(400μg/mL)均可明显增加HAECs细胞的MDA含量，分别比对照组增加2.50和3.42倍(P<0.01)。见表1。

表1PM2.5对HAECs的细胞毒性作用

2.2 PM2.5促进HAECs细胞凋亡

与对照组比较，高浓度(400 μg/mL)PM2.5染毒12 h, 可明显增加HAECs的细胞凋亡率(9.1%,P<0.01);而中浓度(200 μg/mL)和高浓度(400 μg/mL)PM2.5染毒24 h, 能够显著增高HAECs的细胞凋亡率，分别为9.48%和15.7%(P<0.01),DAPI染色结果显示：PM2.5染毒后，HAECs的细胞核浓缩深染，可见凋亡小体。见图1,表2。

图1 PM2.5诱导HAECs细胞凋亡(DAPI染色×200);

A HAECs细胞对照组以完全培养基培养，细胞凋亡率低；B HAECs细胞400 μg/mL的PM2.5混悬液染毒培养，细胞凋亡率显著增加

表2 PM2.5诱导HAECs细胞凋亡

2.3 PM2.5诱导HAECs细胞的炎性反应和ROS

与对照组比较，PM2.5染毒12 h, 中浓度(200 μg/mL)和高浓度(400 μg/mL)均明显提高HAECs细胞培养上清中的IL-1β和IL-18的含量，且PM2.5染毒24 h后，IL-1β和IL-18含量的增加更为显著(P<0.01),这说明PM2.5暴露对HAECs细胞的促炎效应存在剂量和时间依赖关系；PM2.5染毒可促进HAECs细胞内总ROS和mtROS水平的升高，并且呈现剂量依赖效应(P<0.01)。见表3。

2.4 ROS介导了PM2.5诱导的HAECs细胞内NLRP3炎症小体的活化

NLRP3 siRNA可抑制HAECs细胞中NLRP3的表达，PM2.5染毒24 h后，caspase-1 p20和IL-1β表达明显上调，这说明NLRP3炎症小体被活化，而NLRP3 siRNA+PM2.5染毒则部分抑制了这种上调。NAC(细胞总ROS抑制剂)和TEMPO(线粒体ROS抑制剂)预处理对HAECs细胞NLRP3炎症小体活化没有影响，但可部分抑制PM2.5诱导的HAECs细胞内NLRP3炎症小体的活化。这表明ROS部分介导了PM2.5诱导的HAECs细胞内NLRP3炎症小体的活化。见图2。

2.5 NLRP3 siRNA减弱了PM2.5对HAECs细胞的影响

siRNA抑制NLRP3的表达后，可减弱PM2.5对HAECs细胞活力的影响，减少PM2.5诱导的HAECs细胞中LDH和MDA的释放，并且降低PM2.5诱导的HAECs的细胞凋亡，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 PM2.5诱导HAECs的ROS和炎性反应

图2 ROS介导PM2.5诱导HAECs细胞内NLRP3炎症小体的活化；

A Western Blot验证NLRP3 siRNA的抑制效率；B PM2.5可诱导NLRP3炎症小体活化；C ROS抑制剂不影响NLRP3炎症小体活性；D ROS抑制剂可部分抑制PM2.5诱导NLRP3炎症小体活化

表4 NLRP3 siRNA抑制PM2.5对HAECs细胞的影响

3、讨论

空气污染可促进动脉粥样硬化的形成和发展，还会引发心肌缺血、心律失常、心力衰竭、猝死等心血管疾病，但其机制目前尚未阐明[8]。血管内皮细胞是循环血液与血管壁之间的屏障，直接感受血液中各种因素的刺激，通过合成和释放多种活性物质而调节和维持血管稳态。血管内皮损伤是多种心血管疾病的关键因素[9]。有研究显示，PM2.5损伤血管内皮细胞可能是氧化应激和炎性反应等多机制参与的复杂过程[10]。目前针对血管内皮细胞损伤的研究主要使用人脐静脉内皮细胞，鲜少使用HAECs细胞，但脐静脉内皮细胞有干细胞潜能，而且与动脉内皮细胞特性不同，以脐静脉内皮细胞代替动脉内皮细胞进行实验会产生偏差[11],故本研究采用HAECs细胞为研究对象。

本研究建立了PM2.5诱导的HAECs细胞损伤模型，与PM2.5诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的研究结果相似[12],我们发现随着PM2.5染毒时间延长和浓度增高，HAECs细胞活力逐渐降低，同时伴随有LDH释放量的增加。LDH的释放间接反映了细胞膜完整性的破坏和通透性增加，是评价细胞毒性的常用指标之一。LDH释放量增加与HAECs细胞活力降低均表明PM2.5诱导了HAECs细胞的损伤。

许多研究证实氧化应激是PM2.5诱导内皮细胞损伤的机制之一。王芳等[13-14]用PM2.5处理血管内皮细胞，细胞内ROS生成量随染毒剂量增高而增加。本研究同时观察了PM2.5染毒对HAECs细胞内总ROS和mtROS生成的影响，发现PM2.5处理后HAECs细胞内总ROS和mtROS水平均升高，并随染毒时间延长和染毒浓度增加而增加。而且，还发现PM2.5处理后HAECs细胞内MDA含量增加。MDA是ROS与细胞膜不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，是评价氧化损伤程度的标志物之一，其含量增加反映氧化应激损伤加剧[15]。这些结果表明PM2.5诱导了HAECs细胞的氧化应激损伤。

除氧化应激外，炎性反应是PM2.5致机体损伤的另一机制。万强等[16]用PM2.5处理人脐静脉内皮细胞，TNF-α的表达随染毒剂量的升高而增加。刘思岑[12]的研究显示人脐静脉内皮细胞IL-1β、IL-10、IL-12p70和TNF-α的表达随PM2.5浓度的增加而上调。孙乐山等[17]的研究发现PM2.5浓度的增加显著上调了心血管疾病患者IL-8等炎性因子的表达。仝国辉等[18]的研究显示PM2.5通过激活NLRP3炎性小体诱导小鼠肺炎性反应。与上述研究结果相似，本实验研究结果显示NLRP3炎症小体随PM2.5染毒剂量增加和时间延长而活化，且伴有炎性因子IL-1β和IL-18的表达上调。这说明炎性反应参与了PM2.5对HAECs细胞的损伤过程。

本研究还发现以细胞内总ROS和mtROS特异性抑制剂抑制氧化应激反应，可部分抑制PM2.5诱导的HAECs细胞中NLRP3炎性小体的活化，以siRNA抑制NLRP3的表达可部分逆转PM2.5对HAECs细胞的影响。这说明PM2.5染毒引发了HAECs细胞的氧化应激反应，进而活化NLRP3炎性小体，产生大量炎性因子，最终导致HAECs细胞活力降低和凋亡增加。

综上所述，氧化应激活化NLRP3炎症小体部分介导了PM2.5致HAECs细胞的损伤。

参考文献:

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基金资助:河北省自然科学基金(编号:H2020402004); 邯郸市科学技术研究与发展计划项目(编号:19422083008-67);

文章来源:南凯,张俊芳,梁爽,等.PM2.5诱导NLRP3炎症小体活化对人主动脉内皮细胞的影响[J].河北医药,2024,46(15):2266-2270.