91学术服务平台

您好,欢迎来到91学术官网!业务合作:91xueshu@sina.com,站长邮箱:91xszz@sina.com

发布论文

论文咨询

SCNN1B在卵巢癌组织中的表达及启动子区甲基化水平

  2024-08-12    19  上传者:管理员

摘要:目的 检测SCNN1B基因在卵巢癌及正常卵巢组织中甲基化水平,并检测SCNN1B mRNA表达水平,探讨其与卵巢癌发生、发展关系。方法 收集2019年9月至2022年12月在北京佑安医院及石家庄市人民医院行手术治疗的卵巢癌患者62例为病例组,选取65例同期因宫颈癌、子宫肌瘤或盆腔脏器脱垂行全子宫双附件切除术患者的正常卵巢组织为对照组。焦磷酸测序检测SCNN1B基因启动子区甲基化水平,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测SCNN1B基因mRNA的表达水平。结果 与正常卵巢组织比较,卵巢癌组织中SCNN1B基因启动子区甲基化水平显著增高,而SCNN1B基因mRNA表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。对SCNN1B基因启动子区的甲基化水平与SCNN1B基因mRNA表达水平在卵巢癌样本中的相关性分析表明,两者之间存在显著的负相关性(r=-0.692,P<0.01)。卵巢癌组织中SCNN1B基因启动子区甲基化水平、SCNN1B基因mRNA水平与患者FIGO分期相关,且还与淋巴结转移相关(P<0.05)。结论 高甲基化的SCNN1B基因启动子使SCNN1B表达沉默,可能参与卵巢癌癌变和进展。

  • 关键词:
  • SCNN1B
  • 卵巢癌
  • 恶性肿瘤
  • 抑癌基因
  • 甲基化
  • 加入收藏

卵巢上皮性癌为女性常见的恶性肿瘤,因发病隐匿,多数患者就诊时已为晚期,其致死率位居女性生殖道系统恶性肿瘤的首位[1,2]。近年来,虽然对卵巢癌的诊断和治疗取得明显进步,但晚期患者5年生存率仍为40%左右[3]。SCNN1B是一种新近发现的抑癌基因,在多种恶性肿瘤组织中表达下调,且表达受其基因启动区子甲基化水平调控[4-6]。然而SCNN1B与卵巢癌的关系尚未见研究报道。前期我们分析了GEO基因甲基化数据集 GSE81224,结果显示SCNN1B基因启动子区甲基化水平在卵巢上皮性癌组织中显著增高,因此推测高甲基化的SCNN1B可能在卵巢癌发生、发展过程中起作用。本研究将进一步检测SCNN1B基因在卵巢癌及正常卵巢组织中甲基化水平,并检测SCNN1B基因mRNA表达水平,分析它们与卵巢上皮性癌发生、发展的关系,为卵巢上皮性癌的早期诊断、治疗提供潜在的标志物或分子靶点。


1、资料与方法


1.1 一般资料

本次研究经医院伦理委员会批准通过,所需组织标本收集和病例资料均经患者及家属知情同意。病例组纳入2019年9月至2022年12月于北京佑安医院或石家庄市人民医院接受手术治疗的卵巢上皮性癌病例62例,术后病理结果均确诊为卵巢上皮性癌,且在手术前未接受新辅助化疗。年龄23 ~ 74岁,平均年龄(53.3±9.2)岁。对照组为65例正常卵巢组织,分别取自于同期因早期宫颈鳞状细胞癌、子宫平滑肌瘤或盆腔脏器脱垂行手术切除全子宫双附件患者。对照组年龄29~73岁,平均年龄(50.6±13.3)岁。2组患者年龄,差异无统计学意义(P>0.05)。收集的卵巢上皮性癌组织和正常卵巢组织均在手术离体后,立即放在含RNAlater液的冻存管内,在4 ℃冰箱放置一夜后转入-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

RNAlater液购买于美国Carlsbad公司;DNA提取试剂盒购买于德国QIAGEN公司;EZ DNA Methylation Kits试剂盒购买于美国Zymo公司;于南京诺唯赞生物科技股份有限公司购买TRIzol试剂盒和RNA反转录试剂盒;于德国QIAGEN公司购买Go Taq Green Master Mix试剂盒;于上海生工合成并提供PCR 引物。

1.3 方法

1.3.1 提取组织DNA及进行焦磷酸测序(Pyrosequencing):

为了从卵巢癌和正常卵巢组织中提取DNA,遵循DNA提取试剂盒的说明书进行操作。随后,使用Qubit 3.0 Fluorometer和NanoDrop One的分光光度计对提取的DNA样本进行了定量分析。进一步采用EZ DNA Methylation Kits试剂盒对组织DNA进行亚硫酸氢盐转化处理。依据GEO基因甲基化数据集 GSE81224的结果对SCNN1B基因启动子区141bp的碱基片段(hg19,chr16:23313232-23313372)进行了焦磷酸测序,使用PyroMark Assay Design Software 2.0软件设计PCR引物和Pyro引物,并完成引物合成。引物序列:上游引物5’-GTA GGG GTG TGG ATG TGA-3’;下游引物5’–ACC CCA CCT CCC CTC AAT ACA T-3’;Sequencing引物5’-ACA CTC CAT CCC ACC-3’。应用Taq酶对样品的目的基因片段进行PCR扩增,然后在PyroMark Q48检测仪上进行焦磷酸测序。应用Pyro Q-CpG软件获得每个样品每个CpG位点的甲基化水平。取目的基因片段所有CpG位点甲基化水平的平均值进行甲基化差异分析。

1.3.2 组织RNA提取及RT-qPCR检测:

对卵巢癌及正常卵巢组织RNA的提取,使用 TRIzol试剂盒,并通过NanoDrop One光度计对提取的RNA进行纯度和浓度的测定。随后,利用RevertAid cDNA合成试剂盒将RNA逆转录成cDNA,再进行定量PCR(qPCR)的扩增过程。qPCR反应的体系包括Rox 0.1 μL、Green Master Mix 10.0 μL、各1.0 μL的上下游引物、2.0 μL的模板cDNA以及5.9 μL的去离子水,总体积为20 μL。反应条件设定为:95 ℃预变性5 min; 40个循环包括95 ℃变性15 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸25 s; 最后再进行1次95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s、95℃延伸30 s的循环。所使用的引物为SCNN1B基因的上游引物 5’-GTC AGC GTC TCC CTC TCC GTA G-3’和下游引物5’-TCC ATC AGC TCA TCC AGG TCC TTC-3’,以及GAPDH基因的上游引物 5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TA-3’和下游引物 5’-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’。通过2-ΔΔCT法依据系统的CT值计算,得出样本中mRNA的相对表达量,设置3副孔,并取平均值。

1.4 统计学分析

应用SPSS 24.0统计软件,计量资料以

表示,采用t检验或单因素方差分析,相关性采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。


2、结果


2.1 卵巢癌组织中SCNN1B基因甲基化水平

通过焦磷酸测序,检测了SCNN1B基因启动子区长141bp片段(hg19,chr16:23313232-23313372)的8个CpG位点的甲基化水平,取这8个CpG位点甲基化水平的平均值进行病例组和对照组甲基化水平比较。2组SCNN1B基因的平均甲基化水平为差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1SCNN1B基因在卵巢癌和正常卵巢组织中甲基化水平

2.2 卵巢癌组织中SCNN1B基因mRNA表达水平

卵巢癌与正常卵巢组织比较,SCNN1B mRNA的表达水平有显著差异(P<0.01)。见表2。

表2卵巢癌和正常卵巢组织中SCNN1B基因mRNA的表达情况

2.3 SCNN1B启动子区甲基化水平与SCNN1B mRNA表达的关系

SCNN1B基因启动子区的甲基化水平与SCNN1B基因mRNA表达水平之间存在显著的负相关关系(r=-0.692,P<0.001)。这一发现暗示了SCNN1B基因在卵巢癌中的表达可能受到其启动子区甲基化状态的调控。

2.4 卵巢癌患者不同临床病理特征SCNN1B基因启动子区甲基化水平的差异

SCNN1B基因启动子区甲基化水平在年龄、病理类型、组织学分级中的比较,差异无统计学意义(P>0.05);而在FIGO分期为Ⅲ、Ⅳ期的卵巢癌组织中SCNN1B基因启动子区甲基化水平较FIGO分期为Ⅰ、Ⅱ期的显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),卵巢癌病例的癌组织中SCNN1B基因启动子区的甲基化水平在淋巴结阳性的患者中显著高于淋巴结阴性患者(P<0.05)。见表3。

表3卵巢癌患者不同临床病理特征SCNN1B基因启动子区甲基化水平

2.5 卵巢癌患者不同临床病理特征SCNN1B mRNA表达水平的差异

SCNN1B基因mRNA在卵巢癌患者不同年龄、肿瘤病理类型、组织学分级中表达水平相似,差异无统计学意义(P>0.05);而 Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者中SCNN1B mRNA表达水平明显低于FIGO分期为Ⅰ、Ⅱ期的卵巢癌患者,此外,淋巴结阳性的卵巢癌病例癌组织中SCNN1B基因mRNA表达水平与淋巴结转移阴性卵巢癌患者比较,也显著降低(P<0.05)。见表4。


3、讨论


本项研究检测了SCNN1B基因在卵巢癌样本中的启动子区甲基化水平以及SCNN1B mRNA在卵巢癌样本中的表达水平。研究发现,SCNN1B基因启动子区在卵巢癌样本中的甲基化水平明显高于正常卵巢组织,同时SCNN1B mRNA在卵巢癌样本中的表达水平明显低于正常卵巢组织。此外,SCNN1B基因启动子区的甲基化水平以及mRNA的表达水平与卵巢癌患者的FIGO分期和淋巴结转移状况存在相关性。

SCNN1B属于一种编码稳定上皮钠通道的β亚单位的基因,控制不同器官组织中水和电解质的跨上皮转运过程,以及细胞分化过程,SCNN1B还参与多种恶性肿瘤的发生和发展[7]。Qian等[8]报道了SCNN1B通过抑制c-Raf和MEK-ERK信号通路的激活,从而抑制大肠癌的发生。在胃癌AGS、BGC823、MGC803和MKN45细胞株中,过表达SCNN1B可抑制胃癌细胞株增殖和侵袭能力,促进胃癌细胞株凋亡[6]。此外,研究发现SCNN1B在非小细胞肺癌、宫颈癌、肾透明细胞癌等组织中表达下调[9-11]。这些研究结果表明SCNN1B是一种抑癌基因。然而关于SCNN1B基因与卵巢癌之间的联系,至今未被探索。在本研究中,我们分析了卵巢癌样本中SCNN1B mRNA的表达水平,并发现其表达量较正常卵巢组织显著降低,这可能意味着SCNN1B的低表达与卵巢癌的发生有关。进一步的观察显示,SCNN1B在有淋巴结转移的卵巢癌组织中的表达减少更为明显,提示SCNN1B的降低可能促进癌细胞的转移能力。除此之外,SCNN1B 在FIGO Ⅲ、Ⅳ期患者癌组织中表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期患者癌组织中的表达,这表明SCNN1B的表达水平可能与患者的预后相关。

表4卵巢癌患者不同临床病理特征SCNN1B mRNA表达水平的差异

DNA甲基化是一种表观遗产学修饰机制,它通过DNA甲基化转移酶的作用,在CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上添加甲基,而对DNA的碱基序列无直接改变[12-13]。高甲基化的基因启动子区可导致基因转录活性显著降低甚至完全沉默,低甲基化可提高基因的转录活性[14-15]。DNA甲基化状态改变是引起肿瘤发生的一个重要因素,已被视为人类肿瘤细胞的生物标志之一[16-17]。研究表明卵巢癌患者存在多个基因的异常甲基化,如:Das等[18]研究发现卵巢癌患者血清中BRCA1基因启动子呈显著高甲基化状态;Li等[19]报道了GRN1基因启动子区甲基化状态与卵巢癌患者铂类化疗反应相关,高甲基化的GRN1基因可导致患者铂类耐药,从而造成患者差的预后;Jin等[20]检测了Wnt5a在卵巢癌和正常卵巢组织中的甲基化水平情况, 结果显示,Wnt5a基因启动子区的甲基化水平在卵巢癌组织明显高于正常卵巢组织,相反Wnt5a的表达水平在卵巢癌组织中显著下调。

本研究创新性地使用焦磷酸测序方法检测卵巢癌病例中SCNN1B基因启动子的甲基化水平,结果显示SCNN1B基因启动子区甲基化水平在卵巢癌组织中显著升高,相反地,SCNN1B基因mRNA表达水平明显降低。这与先前的研究结果相似。Luo等[21]报道了SCNN1B在大肠癌组织中低表达可能是由其基因启动子区高甲基化调控的。Pierandrei等[22]在多个细胞系中检测了SCNN1B基因启动子区甲基化水平及其表达情况,结果发现SCNN1B基因启动子区呈甲基化状态,对应的SCNN1B表达下调。在本项研究中,还发现卵巢癌病例中FIGO 分期为Ⅲ、Ⅳ期的组织中SCNN1B基因启动子的甲基化水平明显高于FIGO 分期为Ⅰ、Ⅱ期的患者组织;除此之外,卵巢癌患者淋巴结阳性的癌组织中SCNN1B启动子区甲基化水平与淋巴结转移阴性的卵巢癌患者相比,显著增高,提示高甲基化的SCNN1B基因启动子区可能参与卵巢癌癌变及进展。

本研究主要不足之处包括:(1)未对患者进行术后随访,因此不能分析SCNN1B基因启动子区甲基化水平对卵巢癌患者预后的影响;(2)未检测SCNN1B在卵巢癌组织中的蛋白表达水平;(3)未深入研究SCNN1B在卵巢癌发生、发展过程中调控的下游分子及作用机制。

总之,SCNN1B基因启动子区在卵巢癌组织中呈高甲基化,SCNN1B mRNA表达下调,且与患者FIGO分期及淋巴转移相关,表明高甲基化的SCNN1B使其表达沉默可能参与卵巢癌癌变及进展。进一步深入探索SCNN1B作用机制,有望使其成为卵巢癌诊断的标志物和治疗靶点。


基金资助:河北省医学科学研究课题计划(编号:20231597);


文章来源:刘馨,赵健,刘青.SCNN1B在卵巢癌组织中的表达及启动子区甲基化水平[J].河北医药,2024,46(15):2320-2323.

分享:

91学术论文范文

相关论文

推荐期刊

网友评论

加载更多

我要评论

中国肿瘤

期刊名称:中国肿瘤

期刊人气:2072

期刊详情

主管单位:中华人民共和国卫生部

主办单位:中国医学科学院(全国肿瘤防治研究办公室)

出版地方:浙江

专业分类:医学

国际刊号:1004-0242

国内刊号:11-2859/R

邮发代号:32-100

创刊时间:1992年

发行周期:月刊

期刊开本:大16开

见刊时间:一年半以上

论文导航

查看更多

相关期刊

热门论文

推荐关键词

【91学术】(www.91xueshu.com)属于综合性学术交流平台,信息来自源互联网共享,如有版权协议请告知删除,ICP备案:冀ICP备19018493号

400-069-1609

微信咨询

返回顶部

发布论文

上传文件

发布论文

上传文件

发布论文

您的论文已提交,我们会尽快联系您,请耐心等待!

知 道 了

登录

点击换一张
点击换一张
已经有账号?立即登录
已经有账号?立即登录

找回密码

找回密码

你的密码已发送到您的邮箱,请查看!

确 定