首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤细胞论文 > 弥漫性大B细胞性淋巴瘤中程序性PD-L1、p53、C-myc的表达及意义

弥漫性大B细胞性淋巴瘤中程序性PD-L1、p53、C-myc的表达及意义

2020-06-20 1772 上传者：管理员

摘要：目的：探讨程序性死亡配体-1(PD-L1)、p53、C-myc蛋白在弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)中的表达及其与临床病理特征的关系。方法：采用免疫组化法检测50例DLBCL组织中的PD-L1、p53及C-myc蛋白的表达，分析其与临床病理特征的关系，同时对C-myc阳性病例进一步行FISH检测筛查高级别B细胞性淋巴瘤(HGBL)。结果：50例DLBCL中瘤细胞PD-L1、p53、C-myc阳性率分别为42%(21/50)、18%(9/50)、14%(7/50),PD-L1的表达与Hans分型有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、发病部位、Ki-67指数、AnnArbor分期、国际预后指数(IPI)评分、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平、ECOG评分及有/无B症状无关(P>0.05);p53、C-myc表达与DLBCL的临床病理特征之间均不具有相关性(P>0.05)。FISH检测结果未出现高级别B细胞性淋巴瘤。结论：PD-L1在DLBCL中高表达，且在非生发中心B细胞样(non-GCB)亚型中有更高的阳性率，可为临床应用抗PD-L1免疫抑制剂行免疫治疗提供理论依据。

关键词：
p53
免疫组化
弥漫性大B细胞性淋巴瘤
程序性死亡配体-1
加入收藏

弥漫性大B细胞性淋巴瘤是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤,CD20单抗美罗华的应用显著改善了疾病预后，但仍有30%～40%的患者因原发性耐药或复发而死亡[1]。免疫靶点治疗在现阶段多种肿瘤治疗中取得了重要进展，有研究证实程序性死亡因子-1(programmeddeath-1,PD-1)及其配体-1(programmeddeath-ligand1,PD-L1)信号通路在DLBCL的发病中起重要作用，PD-L1可能是DLBCL的一个免疫检查点[2]。p53和C-myc是抑癌基因TP53和原癌基因MYC在蛋白水平的表达，二者直接或间接参与了PD-1/PD-L1通路作用机制[2]。本实验旨在通过免疫组化方法检测DLBCL组织中PD-L1、p53和C-myc的表达水平，并分析三者表达与弥漫性大B细胞性淋巴瘤患者临床病理特征及其相互之间的关系，为DLBCL临床免疫治疗的探索及疾病预后判断提供有价值的信息。

1、材料与方法

1.1材料

收集2014-02—2018-12间华北理工大学附属医院病理科确诊为DLBCL的石蜡标本50例，诊断标准参照WHO(2017)造血与淋巴组织肿瘤分类[3]，所有病例术前均未行化疗和放疗，临床病例资料完整。其中男性28例，女性22例;年龄23～85岁，中位年龄61岁。非特殊类型弥漫性大B细胞性淋巴瘤44例，原发中枢神经系统的弥漫性大B细胞性淋巴瘤(CNSDLBCL)2例，原发皮肤弥漫性大B细胞性淋巴瘤，腿型(PCLBCL)1例，原发纵隔(胸腺)大B细胞性淋巴瘤1例，EB病毒阳性弥漫性大B细胞性淋巴瘤，非特指型2例。按Hans分型法:生发中心B细胞样型33例，非生发中心B细胞样型17例。

1.2方法

1.2.1免疫组化

所有标本经4%中性甲醛固定、常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，行免疫组化EnVision法染色。所用抗体PD-L1(克隆号SP263)单克隆抗体购于瑞士Roche公司，鼠抗人p53(克隆号ZM-0408)和C-myc(克隆号ZA-0555)单克隆抗体均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。EnVision免疫组化试剂盒、生物素标记二抗工作液和辣根酶标记链霉卵白素工作液等均由华北理工大学附属肿瘤医院病理科提供。用PBS液代替一抗作为阴性对照，操作按试剂盒说明书进行。

1.2.2FISH

MYC、BCL2、BCL6基因断裂探针试剂盒购于武汉康录生物公司。4μm石蜡切片经脱蜡通透至水，蛋白酶37℃消化10min，梯度乙醇脱水干燥。暗室中滴加探针，盖玻片橡皮胶封边，85℃共变性5min,42℃杂交8h;取出玻片，去除橡皮胶，2×SSC液洗涤并用镊子轻轻将盖薄片揭去;室温2×SSC洗涤1min,68℃0.3%NP-40/0.4×SSC溶液洗涤2min,37℃去离子水浸泡1min，暗处自然干燥玻片。DAPI复染，封片镜检。

1.3结果判定

(1)免疫组化结果:PD-L1阳性染色定位于细胞膜，为黄色或棕黄色，当任何着色强度的肿瘤细胞≥25%时定义为阳性[4]。p53、C-myc阳性染色均定位于细胞核，为黄色或棕黄色，当p53着色肿瘤细胞≥50%、C-myc着色肿瘤细胞≥40%时定义为阳性。(2)FISH结果:红色信号代表5’端信号，绿色信号代表3’端信号。2个黄色融合信号(2F)为阴性细胞，1红1绿1融合(1R1G1F)或2红2绿信号(2R2G)为阳性细胞。随机计数200个细胞，每个细胞计数1次，只计数有杂交信号的细胞(两种颜色信号均有)。1R1G1F信号和2R2G信号>15%为阳性;1R1G1F信号和2R2G信号<15%为阴性;阳性细胞的比例=15%时，加大计数数目或分析整张片子;若仍≤15%则判读为阴性，否则为阳性。

1.4统计学分析

应用SPSS22.0软件进行统计学分析，组间比较均采用χ2检验和Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman秩相关分析。

2、结果

2.1PD-L1、p53和C-myc的表达

50例DLBCL标本中，PD-L1、p53及C-myc的阳性率分别为42%(21/50)、18%(9/50)和14%(7/50)(表1，图1～3)。

图1在DLBCL细胞胞膜中PD-L1(+)EnVision两步法

图2在DLBCL细胞胞核中p53(+)EnVision两步法

图3在DLBCL细胞胞核中C-myc(+)EnVision两步法

表1PD-L1在DLBCL及反应性增生的扁桃体组织中的表达

2.2PD-L1、p53、C-myc表达与DLBCL临床病理特征的关系

PD-L1的表达与Hans分型有关，nonGCB型中阳性率70.6%(12/17)，显著高于GCB型的阳性率27.3%(9/33)，差异显著(P<0.05);而与患者的性别、年龄、原发部位、Ki-67指数、AnnArbor分期、IPI评分、血清LDH水平、ECOG评分及有/无B症状无关(P>0.05)。p53、C-myc的表达与DLBCL的临床病理特征之间均不具有相关性(P>0.05，表2)。

表2PD-L1、p53、C-myc与DLBCL临床病理特征的关系

2.3PD-L1与p53和C-myc表达的相关性

PD-L1与p53和C-myc表达均无相关性(P>0.05，表3)。

表3PD-L1与p53及C-myc表达的相关性

2.4MYC、BCL2、BCL6基因重排

7例C-myc蛋白表达阳性的双表达/三表达病例均为非特殊类型DLBCL，其中2例因标本量太少未能完成FISH检测，其余5例结果为单基因重排或无基因重排(1例仅出现C-myc断裂探针信号，2例仅出现BCL-6断裂探针信号，2例3基因均未出现断裂探针信号(图4)。

图4MYC基因重排，箭头所示为C-MYC断裂探针信号(1R1G1F)FISH

3、讨论

PD-1及其PD-L1信号通路是阻止肿瘤免疫逃逸的重要作用靶点。PD-1/PD-L1免疫检查点治疗已在多种实体肿瘤中初见成效，而免疫组化法是目前临床评估肿瘤组织PD-L1表达水平的最适宜手段。大量研究表明，肿瘤组织中PD-L1表达水平越高，则意味着患者更有可能从PD-1/PD-L1抑制剂治疗中获益[5]。

截止2019年底美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了5种PD-1/PD-L1阻断剂用于治疗几种实体肿瘤和经典霍奇金淋巴瘤一线治疗失败的患者，相应的PD-L1抗体克隆号分别为22C3、SP263、SP142和28-8。不同临床试验设定的PD-L1cut-off值从1%～50%不等，取决于不同瘤种和药物[6]。在弥漫性大B细胞性淋巴瘤领域，不同克隆号的PD-L1判读还没有统一的标准，导致报道PD-L1的阳性率也各不相同。Fang等[7]以10%的cut-off值为标准，测得PD-L1(SP142)在76例中国DLBCL患者肿瘤样本中TC表达率为26.3%。Kwon等[8]同样以10%作为临界点，却在61.1%(77/126)的DLBCL中观察到PD-L1表达。目前，涉及SP263的文献报道仅有1篇[4]，其通过对PD-L1SP142和SP263在DLBCL组表达情况的对比，指出SP263在评估和识别着色的肿瘤细胞中更具优势。本实验证实了PD-L1在DLBCL中有较高的表达率，为未来DLBCL的免疫治疗提供了有力的实验数据。本组研究在截断值较为严格的设定下，依然获得了较高的PD-L1表达率，此现象是否与SP263的高敏感性有关，还有待今后补充其他抗体型号进行分析。实验结果同时证明，nonGCB型DLBCL中PD-L1的表达率明显高于GCB型，二者差异显著，提示预后较差的nonGCB型DLBCL患者具有新的治疗前景。这与梁莉等[9]的研究结果相符。

p53蛋白是TP53基因编码的产物，在DLBCL中的阳性率为20%～60%[10,11]，而其表达与PD-L1的关系国内外报道十分少见。袁英等[12]的研究证明，p53在nonGCB型DLBCL中表达率更高，p53表达与PD-L1表达呈显著正相关。宋琪等[13]则报道p53表达与IP评分、临床分期、疗效和预后有关，而与Hans分型无关。本实验中p53的表达率略低，或与部分组织保存时间较长从而影响了抗原表达有关。但与各项病理特征及PD-L1表达的关系，尚需在今后扩大样本量继续验证。

原癌基因MYC位于染色体8q24，是人类致癌最频繁的基因之一。染色质免疫沉淀测序分析证实MYC通过与CD47及PD-L1的启动子结合，在转录水平直接调节二者的表达，从而抑制先天性和适应性抗肿瘤反应，有助于肿瘤的生长和维持[14]。WHO(2017)血液系统肿瘤分类中将伴有双打击/三打击的弥漫性大B细胞性淋巴瘤归类为高级别B细胞淋巴瘤(HGBL)，以提示疾病的高侵袭性及高进展性，并指出DLBCL中出现双打击的概率为4%～8%。林珍珍等[15]报道的58例B细胞淋巴瘤中仅有2例为双打击，1例为三打击。本实验5例双表达/三表达DLBCL中未能发现HGBL，与此疾病的低发生率相一致，也证实了C-myc表达的激活机制不止重排，还有如微RNA扩增或突变等，同时也提示对HGBL的诊断更应审慎。

在分子层面，迄今为止仅有1篇报道指出LBCL患者的PD-L1在MYC易位或双打击中低表达，或使此类患者应用PD-L1/PD-1抑制剂治疗受益较少[16]。另有报道提出，p53的表达与具有非常态的MYC基因(MYC额外拷贝、MYC重排、MYC过表达)的DLBCL显著相关，且p53对预后的不良影响仅见于MYC重排淋巴瘤[17]。本实验将在今后扩大基因检测样本并进行预后随访，进一步探讨MYC基因重排与PD-L1、p53表达的相关性。

综上所述，PD-L1在DLBCL中高表达且与Hans分型有关，PD-L1在nonGCB中拥有更高的表达率。从涵盖4174名患者的meta分析来看[18],PD-L1的表达程度与疗效正相关，但即使是表达阴性的患者仍然能从免疫治疗中获益。因此，PD-L1有望成为精准医疗时代淋巴瘤免疫靶点治疗的新希望。联合p53及C-myc检测有助于判断DLBCL的肿瘤状态及疾病预后。

参考文献：

[9]梁莉,夏瑞祥,葛健.程序性细胞死亡受体1配体在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义[J].安徽医药,2018,22(9):1706-1709.

[12]袁英.p53､PD1和PDL1在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其对预后的影响[D].天津医科大学,2018.

[13]宋琪,任翠爱,卞倩玉,等.C-Myc,Bcl-6,p53在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义[J].潍坊医学院学报,2018,40(3):226-229.

[15]林珍珍,黄菲,马晓梅,等.BCL-2､BCL-6､C-MYC基因重排的高级别B细胞淋巴瘤临床病理分析[J].临床与实验病理学杂志,2019,35(8):906-910.

吴晨阳,王潇飞,张爽,罗丹,董丽儒,宋旭东.PD-L1､p53､C-myc在弥漫性大B细胞性淋巴瘤中的表达及意义[J].诊断病理学杂志,2020,27(06):408-412.