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鲜天麻多指标成分含量检测应用HPLC法的价值

2020-08-01 318 上传者：管理员

摘要：建立HPLC法对鲜天麻的天麻素、腺苷、羚基苯甲醛、羚基苯甲醇等指标含量测定。建立YMC-PEAKODS-Acolumn(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为甲醇0.1%醋酸水溶液，进行梯度洗脱，设定1ml•min-1的流速、35℃柱温、270mm检测波长。经本次检测试验发现这四类指标成分形成良好峰面积线性关系分别为，天麻素为19.2～382mg•L-1，腺苷为0.621～12.5mg•L-1，羚基苯甲醛为0.281～5.64mg•L-1，羚基苯甲醇为2.46～49.1mg•L-1。达到9平均加样回收率在96.8%～97.8%之间浮动，RSD在1.6%以内。因此运用HPLC检测方法完成对鲜天麻的多指标成分含量检测，能够获得准确可靠的检测结果和较好的分离度，适用于对这四类指标含量测定。

关键词：
HPLC检测
指标成分
药学
鲜天麻
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天麻隶属兰科，作为多年生草本植物，以四川、云南、湖南、内蒙古、台湾及贵州等地为盛产地区，作为我国的贵重中药材中的一种，干燥块茎作为主要药用部位。目前我国学术界中周铉划分天麻共计五类变型[1]，分别为原变型-红天麻、绿天麻、乌天麻、松天麻、黄天麻。经我国现代药理学及临床研究结果证实，天麻能够有效治疗高血压、偏头痛、失眠、糖尿病、心血管类疾病等症，能够达到息风通络、平抑祛风等效果[2]。近年来学术界有关天麻指标成分研究领域比较重视，现有文献中也提出天麻质量控制，以天麻内的天麻素、羚基苯甲醇含量作为重要依据[3,4,5]。因此本文提出对鲜天麻多指标成分含量运用HPLC法检测研究。

1、仪器与材料

运用岛津LC-10AT型高校液相色谱仪、SPD-10A型紫外检测器、色谱工作站、电子分析天平。本实验室提供98%纯度以上的天麻素、腺苷、羚基苯甲醛、羚基苯甲醇对照品。均对以上四个成分对照品纯度采用HPLC归一化法计算处理。试剂采用重蒸水和分析纯。共计完成12批产地不同鲜天麻试验药品收集，经鉴定为天麻干燥块茎。

2、方法与结果

2.1色谱条件

建立YMC-PEAKODS-Acolumn(250mm×4.6mm,5μm）色谱柱，流动相为甲醇0.1%醋酸水溶液，进行梯度洗脱，设定1ml·min-1的流速、35℃柱温、270mm检测波长、20μL进样量。基于以上色谱条件下，四类成分指标的力论塔板数均在1万以上，分离度以及拖尾因子与成分含量检测需求相符[6]。

2.2制备对照溶液

称取对照组适量四类成分含量，将称取样本置于25ml量瓶内，将10%甲醇加入其中充分稀释摇匀，可以获得分别为384、12.5、49.1、5.64mg·mg·L-1浓度的四类成分混合对照品溶液。

2.3制备供试品溶液

采用过40目筛称取0.5g左右的粉末药材，置于圆底烧瓶并精密称取20ml蒸馏水，完成质量称定后进行加热回流处理提取1h，正常冷却称定最终质量，采用蒸馏水将缺失质量补足后理性处理。在烧瓶内称取5Ml上清液，将20ml甲醇加入进行3min振摇，直至完全沉淀白色絮状再次离心。浓缩上清液近干，将10%浓度甲醇加入溶解残渣，并转移至5ml量瓶内，再运用浓度10%甲醇稀释摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，将滤液取出制备成功。

2.4线性关系结果

分别在10ml量瓶内置入0.5、1.0、2.5、4.0、5.0、10ml，加入10%甲醇摇匀获得不同不同浓度混合对照品溶液。对于以上色谱条件下，分析峰面积Y绘制X浓度标准曲线，可得四类成分指标的回归线性方程结果分别如下：天麻素r=0.9999，腺苷=0.9999，羚基苯甲醛r=0.9996，羚基苯甲醇r=0.9999。发现四类指标成分形成良好峰面积线性关系分别为，天麻素为19.2～382mg·L-1，腺苷为0.621～12.5mg·L-1，羚基苯甲醛为0.281～5.64mg·L-1，羚基苯甲醇为2.46～49.1mg·L-1。

2.5精密度试验

通过取同一混合对照品溶液，与上述同样色谱条件完成反复6次进样，对于不同峰面积进行记录，并对四类成分指标的面积RSD分别计算，结果为0.5%、0.5%、0.5%、1.8%，表示获得HPLC能够获得较好的精密度。

2.6稳定性试验

同样统一取供试品溶液，置于正常室温下记录不同时间点的峰面积，发现在0、3、5、8、12、24h不同时间下，四类指标成分分别达到1.5%、1.9%、1.1%、1.9%的RSD，该结果反映了24h内的试品溶液稳定。

2.7加样回收率试验

通过分别完成精密称取0.25g/份的共计9份既定含量鲜天麻，划分为3组，分别精密加入适量对照品，并根据上述方法完成不同浓度的试品溶液制定，分别为低浓度、中浓度、高浓度，（见表1）作为不同浓度的四类指标成分平均回收率（n=9）。

表1四类成分加样回收率（n=9)

2.8样本含量测定

分别过40目筛完成每份0.5g左右天麻药材称取，同样以如上制备方法完成供试品工业制备，并基于以上设定的色谱条件展开分析，采用外标法完成四类指标成分含量的峰面积计算（见表2）。

表2不同产地鲜天麻指标质量分数

3、讨论

通过在本文试验研究中，对鲜天麻的四种指标成分含量进行测量，分别完成之外200～400rm条件下的对照品溶液扫描，发现天麻素及羚基苯甲醇处于270rm时可以达到最大化吸收，腺苷处于256rm时可以达到最大化吸收，羚基苯甲醛可以达到280rm时的最大化吸收，所以综合考虑确定270rm测定条件，发现对于这四类指标成分均可以获得较好响应值。运用HPLC检测方法完成对鲜天麻的多指标成分含量检测，能够获得准确可靠的检测结果和较好的分离度，适用于对这四类指标含量测定。

参考文献：

[1]朱仕豪,阳楠,欧梓轩,等.天麻主要活性成分分离和鉴定及产地初加工方法对其含量的影响[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2019,45(02):84-88+94.

[2]杨瑞虹,李廷全,李青山.高效液相色谱法测定晕痛宁胶囊中天麻素的含量[J].中国药物与临床,2008,008(011):907-908.

[3]王海燕,梁利香,杨俊杰.多指标综合评价天麻炮制工艺的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2015(7):199-200.

[4]曹小平,许建秦,刘满军,等.多指标综合评分法优选三参降消胶囊的水提取工艺[J].名医,2018,64(09):221-222.

[5]泰瑞清,赵高婷,李蓉涛,等.天麻化学成分影响因素的研究现状[J].云南中医中药杂志,2015,036(007):80-82.

[6]包永睿,王帅,唐爽,等.基于指纹图谱结合多元统计分析的天麻总苷差异指标的研究[J].中药材,2016,39(5):1082-1085.

王准,宋川霞,曹梦蝶.鲜天麻多指标成分含量的HPLC法检测[J].名医,2020(12):329-330.