近年来，全球恶性肿瘤的发病率日益增加。我国肺癌的发病率高居首位，占全部恶性肿瘤的1/5[1]。肺癌侵袭性强，转移迅速，预后不良，其死亡率高达27%[1],5年生存率仅有19.8%[2]，严重影响人类的生命健康。中医药在非小细胞肺癌的治疗中发挥重要的作用。笔者所在单位通过多年临床实践总结出NSCLC的病机，即以正虚为本，邪实为标，痰、瘀、毒相互搏结。已故名中医陈锐深教授创立了仙鱼汤，功效为益气养阴、健脾清肺、化痰祛瘀。临床研究[3,4,5]表明，仙鱼汤具有改善临床症状、提高生存质量、稳定瘤体、防治转移、减轻放化疗的毒副反应、提高免疫力等作用。实验研究证实，仙鱼汤能阻滞肺癌细胞的细胞周期，下调Bal-2的表达，增加细胞凋亡率[6]；降低VEGF、VEGFR2表达从而抑制肿瘤血管生成[5]；下调MMP-2、上调TIMP-2从而抑制肺癌的侵袭转移[7]。但目前仙鱼汤的有效成分及分子机制未能完全阐明。

网络药理学基于“药物-靶点-基因-疾病”网络，应用生物信息数据库，综合分析与疾病、药物相关的基因、蛋白质之间的复杂关系，是研究中药复方药理机制的可靠方法之一[8]。本文运用网络药理学技术，探讨仙鱼汤治疗NSCLC的核心成分及作用通路，确定其科学内涵。

1、材料与方法

1.1仙鱼汤活性成分的筛选

通过TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）对仙鱼汤的12味中药——仙鹤草、鱼腥草、猫爪草、山海螺、党参、三七、山慈菇、浙贝母、守宫、天冬、黄芪、甘草分别进行检索，收集仙鱼汤的活性成分。

口服生物利用度影响了药物吸收、分布、代谢及排泄过程，是重要的药动学参数。在TCMSP数据库中，OB的计算采用了P-糖蛋白和代谢酶CYP3A4、CYP2D6相结合的预测方法。首先使用Sybyl6.9优化化合物的分子结构，并采用Dragon软件计算分子描述符。然后从RCSB数据库（http：//www.rcsb.org/）检索CYP3A4、CYP2D6的晶体结构，并对鼠P-糖蛋白进行同源性建模。运用几何算法识别3种蛋白质的结合模式，并进行迭代分类分析，最后使用SVR非线形回归模型估计OB值[9]。为获得良好的药物生物利用度，限定OB≥30%。

类药性代表化合物与已知药物之间的相似度。Tanimoto系数代表中药化合物和Drugbank数据库（http：//www.Drugbank.ca/）所含药物之间的结构相似性，是TCMSP数据库评估DL值的方法。其计算公式如下：，其中，A代表中药化合物的描述符，B代表Drugbank数据库中所有药物描述符的平均值[10]。限定DL≥0.18。

另外，为避免部分高活性成分因不符合OB、DL的要求而被排除，通过检索中国知网、万方、PubMed数据库以收集对仙鱼汤药理研究有意义的化合物。

1.2仙鱼汤靶点的筛选

在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）上检索仙鱼汤活性成分的SMILES结构，上传至Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）进行作用靶点的搜索。设定可能性>0.4的靶点作为关联性较高的潜在靶点。

1.3中药-活性成分-靶点网络图的构建

将中药、活性成分、靶点输入Cytoscape3.7.0，构建中药-活性成分-靶点网络图，并应用Cytoscape集成的分析工具NetworkAnalyzer进行网络属性分析。

1.4NSCLC疾病靶点的获取

以“non-smallcelllungcancer”作为关键词检索DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home），下载NSCLC的疾病靶点。筛选得分≥0.1的靶点作为NSCLC相关性较高的潜在靶点。

1.5阳性药物靶点的收集

以“non-smallcelllungcancer”作为关键词搜索KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/）中治疗NSCLC的阳性药物及其靶点。另外，参照2019年NCCN指南，在Drugbank数据库中分别检索NSCLC治疗药物的靶点，并排除未经过药理学验证的部分。

1.6韦恩图的绘制

将仙鱼汤、NSCLC、阳性药物的靶点输入R语言3.6.2，绘制韦恩图。

1.7阳性药物的KEGG通路及GO富集分析

将KEGG和Drugbank数据库的靶点汇总、去重，上传至David数据库（http：//David.ncifcrf.gov/）进行KEGG通路分析及GO生物学过程富集分析。点击“FunctionalAnnotation”，选择“OFFICE＿GENE＿SYMBOL”“genelist”，提交后，物种选择“Homosapiens”，之后点击“Gene＿Ontology”下的GOTERM＿BP＿DIRECT以及“pathways”下的“KEGG＿PATHWAY”。设定筛选条件为P<0.05、FDR<0.05，得出阳性药物治疗NSCLC的作用通路。运用Cytoscape3.7.0构建阳性药物-靶点-KEGG通路网络图，并运用R语言3.6.2对GO富集分析结果进行生物学进程气泡图的绘制。

1.8仙鱼汤的KEGG通路富集分析

取仙鱼汤与阳性药物的交集靶点，找出所对应的核心成分，并映射至阳性药物的KEGG通路富集结果上，得到仙鱼汤作用于NSCLC的核心靶点及通路。使用Cytoscape3.7.0绘制仙鱼汤的核心成分-靶点-KEGG通路网络图。

1.9核心靶点的分子对接

选取核心靶点与所对应的核心成分、阳性药物进行分子对接。从RCSB数据库上获取核心靶点的蛋白结构，经pymol2.3.3去除水分子（输入“removesolvent”）和结合的小分子（输入“removeorganic”），保存为PDB格式。从http：//zinc.docking.org/网站下载核心成分或阳性药物的3D结构，保存为mol2格式。使用http：//www.swissdock.ch/线上分子对接工具进行对接。以结合能≤-5.0kJ·mol-1作为配体与受体结合能力的筛选条件。

2、结果

2.1仙鱼汤的活性成分及靶点

运用TCMSP数据库对仙鱼汤的12味中药进行检索，结果发现守宫及山海螺的成分信息未被收录。限定OB、DL进行筛选，删除重复项后获取其余10味药的活性成分155个。从文献中搜索到守宫及山海螺的3个活性成分，其中守宫中的adenine具有阻断细胞周期、促进细胞凋亡作用[11]，山海螺中的lancemasideA、lancemasideB对肿瘤细胞活性具有明显的抑制作用[12]。另外，仙鱼汤中有19个化合物经文献验证具有高活性，但因不符合OB、DL的要求被剔除，故重新纳入分析。其中，黄芪纳入的vanillicacid、lupeol、ononin、soyasaponinI、astragalosideⅢ、astragalosideⅣ、rutin、rhamnocitrin-3-O-glucoside、acetylastragalosideI为入血的活性成分，具有抗氧化和免疫增强等作用[13,14]；猫爪草纳入的palmiticacid促进了A549肺腺癌细胞凋亡[15]；三七纳入的ginsenosideRb1通过逆转上皮间质转化具有抑制肿瘤转移作用[16]、notoginsenosideR1对急性髓系白血病细胞有增殖抑制作用[17]；天冬纳入的aspafiliosideA对乳腺癌细胞具有细胞毒性[18]；党参纳入tangshenosideI[19]、浙贝母纳入peiminine[20]、仙鹤草纳入hyperin、ursolicacid[21]、甘草纳入isoliquiritigenin、isoliquiritin[22]，以上化合物均具有高活性。统计得出仙鱼汤活性成分共177个。经SwissTargetPrediction数据库搜索，去重后可获得靶点1317个，可能性>0.4的潜在靶点有155个。

2.2中药-活性成分-靶点网络图

剔除可能性≤0.4的靶点及对应的中药、活性成分。通过Cytoscape3.7.0绘制中药-活性成分-靶点网络图，见图1。应用NetworkAnalyzer进行网络属性分析，结果显示，11味中药及44个活性成分对应了155个靶点，共有210个节点和449条边。其中，槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、鞣花酸（ellagicacid）的度值（Degree）较高，分别为95、51、45、42，为该网络中的重要成分。

图1仙鱼汤的中药-活性成分-靶点网络图

2.3NSCLC的疾病靶点

通过检索DisGeNET数据库，共获得NSCLC的疾病靶点2242个。得分越高者代表相关性越高，得分≥0.1的潜在靶点有221个。其中，分值较高的靶点有ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、CDKN2A、MET、NFE2L2、CHFR、MXRA5、AKT1、PIK3CA、MAP2K1等。

2.4NSCLC阳性药物的靶点

KEGG数据库中NSCLC的疾病编号为H00014，共收录了24个治疗药物，包括了化疗药、靶向药、免疫治疗药，涉及的靶点共有18个。2019年NCCN指南推荐的NSCLC治疗药物有28个，在Drugbank数据库中搜索并筛选出符合药理学验证的靶点共30个。2个数据库共有15个靶点重合，分别是EGFR、VEGFR2、ALK、ROS1、PDCD1、CD274、ERBB2、ERBB4、RRM1、TYMS、DHFR、GART、NTRK1、NTRK2、NTRK3。以上靶点涉及了目前NSCLC的主要治疗方向，包括酪氨酸激酶受体家族、血管内皮生长因子、细胞程序性死亡蛋白1受体、神经营养因子受体络氨酸激酶家族等。

2.5韦恩图的绘制

将仙鱼汤、NSCLC及阳性药物3者的靶点输入R语言3.6.2，绘制韦恩图。如图2所示，3者的共同靶点有4个，分别是EGFR、VEGFR2、ERBB2、ALK。KEGG、Drugbank数据库的阳性药物与NSCLC的相交靶点有9个，其余5个分别是RRM1、TYMS、PDCD1、CD274、ROS1。仙鱼汤与Drugbank数据库阳性药物的相交靶点有8个，其余4个分别是BRAF、MET、MAPT、TOP2A。

2.6阳性药物的KEGG通路及GO富集分析

KEGG、Drugbank数据库的阳性药物靶点经汇总、去重后共有33个，将靶点上传至David数据库进行KEGG通路富集分析。如图3所示，富集结果共涉及18个靶点和26条信号通路，包括了细胞增殖与凋亡途径如PI3K-Akt、MAPK、FoxO、Ras、ErbB信号通路；血管生成途径如VEGF、HIF-1信号通路；免疫调节途径如自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路、T细胞受体信号通路等。图3中的靶点和通路在目前NSCLC的治疗中起关键作用。

图2仙鱼汤-NSCLC-阳性药物的韦恩图

图3仙鱼汤治疗非小细胞肺癌阳性药物-靶点-通路网络图

运用R语言3.6.2将GO富集分析的26个生物过程结果绘制成气泡图，见图4。气泡图中包括了跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、蛋白质磷酸化、MAPK通路、PI3K信号转导的调控、ERBB2信号通路、细胞表面信号通路、细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡等生物学过程。

图4仙鱼汤治疗非小细胞肺癌阳性药物的GO生物过程富集分析图

2.7仙鱼汤的KEGG通路富集分析

将仙鱼汤与阳性药物交集的核心靶点及对应的活性成分映射到阳性药物的KEGG通路图中，结果见图5。仙鱼汤中的核心成分为槲皮素、山奈酚、大豆黄素（glycitein）、鞣花酸，核心靶点为EGFR、VEGFR2、ERBB2、ALK、BRAF、MET、MAPT，作用通路包括NSCLC、VEGF、PI3K-Akt、ErbB、MAPK、Ras、HIF-1、Rap1信号通路、细胞间隙连接、细胞黏附连接、癌症的蛋白聚糖通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路等23条通路。

2.8核心靶点的分子对接

参照图5，选择靶点EGFR、ALK、ERBB2、VEGFR2与对应的核心成分槲皮素、山奈酚、大豆黄素、鞣花酸进行分子对接，同时选择所对应的阳性药物作为对照，结果见表1。一般而言，配体与受体结合构象越稳定，所需能量越低，结合能<0kJ·mol-1时代表配体和受体可以自发结合。槲皮素、山奈酚、大豆黄素、鞣花酸与核心靶点之间的结合能均<-5kJ·mol-1，提示上述成分与靶点之间的结合活性较好。与阳性药物对比，大豆黄素与EGFR的结合活性优于一代EGFR-TKI药物吉非替尼、厄洛替尼，槲皮素与ALK的结合活性优于一代ALK抑制剂克唑替尼、二代ALK抑制剂艾乐替尼、色瑞替尼。

图5仙鱼汤的核心成分-靶点-通路网络图

3、讨论

仙鱼汤是笔者所在单位的常用方，其功效为益气养阴、健脾清肺、化痰祛瘀，切合了肺癌“虚、毒、痰、瘀”的病理特点。经过前期临床及实验研究证实，仙鱼汤对非小细胞肺癌（NSCLC）有确定的疗效[3,4,5,6,7]，探讨其有效成分及作用机制具有积极意义。

中药-活性成分-靶点网络图表明，仙鱼汤所含的槲皮素、山奈酚、木犀草素、鞣花酸具有较高的度值，是仙鱼汤的重要成分。由仙鱼汤的核心成分-靶点-通路图可知槲皮素、山奈酚、鞣花酸、大豆黄素与核心靶点及通路联系紧密。黄酮类化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素是目前的研究热点，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用[23,24,25]。研究[23]证实，槲皮素在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌等多种癌症中发挥抗肿瘤活性，其作用机制包括阻滞细胞周期、抑制bal-2表达、增加bax-2、capcase-3表达从而诱导线粒体介导的细胞凋亡。山奈酚可促进A549肺癌细胞自噬及凋亡，并通过上调PTEN使PI3K-Akt信号通路失活从而发挥抗细胞增殖、迁移作用[24]。木犀草素通过上调E-cadherin表达、下调vimentin表达，逆转上皮间质转化，抑制肺癌细胞的侵袭及转移[25]。大豆黄素是异黄酮类化合物，通过激活MAPK、阻断STAT3/NF-κB介导了细胞凋亡途径[26]。鞣花酸是一种多酚类化合物，能够降低CIP2A表达水平从而激活肺癌细胞的自噬过程[27]。通过文献检索初步得出，仙鱼汤的重要成分从不同的途径发挥抗NSCLC作用。

KEGG通路分析提示，仙鱼汤的核心靶点为EGFR、VEGFR2、ERBB2、ALK、BRAF、MET、MAPT，作用通路包括NSCLC、VEGF、PI3K-Akt、ErbB、MAPK、Ras、HIF-1、Rap1信号通路、细胞间隙连接、细胞黏附连接、蛋白聚糖通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路等23条通路。以上靶点及通路可归纳为以下几类。第一类是细胞增殖与凋亡途径，如EGFR突变激活了酪氨酸激酶，促进肿瘤细胞的分化、增殖[28];ERBB2与ERBB3结合成二聚体，间接激活PI3K-Akt信号通路[29]；突变的ALK和BRAF通过调节PI3K-Akt-mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK即MAPK级联信号通路，与细胞增殖、凋亡密切相关[30,31]。第二类是血管生成途径，如VEGF/VEGFR2影响血管内皮细胞的增殖与通透性，是肿瘤新生血管的正性调控机制[32];HIF-1α在缺氧环境下过度表达，通过上调VEGF促进肿瘤的血管生成，导致肿瘤的侵袭、转移[33];Rap1b的激活与内皮细胞迁移及增殖、血管新生过程密切相关[34]。第三类是细胞黏附途径，包括细胞黏附连接通路及蛋白聚糖通路，影响了肿瘤的浸润、转移。第四类是免疫调节途径，如自然杀伤细胞能够识别癌细胞，并释放细胞因子及趋化因子，对癌细胞产生细胞毒性[35]。第五类是耐药机制，如MET扩增产生EGFR-TKI的旁路激活途径，引起TKI获得性耐药[36];MAPT影响微管蛋白的稳定性，干扰紫杉醇与微管蛋白结合能力，导致紫杉醇类化疗方案的耐药[37]。以上通路与NSCLC的发生、发展、预后密切相关，印证了仙鱼汤多成分、多靶点、多通路的治疗特点。

综上所述，本研究通过网络药理学方法，分析仙鱼汤治疗NSCLC的有效成分及作用机制，为进一步的分子机制、药物开发等研究提供了参考。但由于本研究是基于数据库信息挖掘技术的预测结果，其结论需要更多的实验研究或临床试验加以证实。

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基金:国家自然科学基金项目(81973815);广东省自然科学基金项目(2017A030313886);广州中医药大学第一附属医院创新强院工程(2017TD01).