骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种常见的代谢性骨疾病，以骨结构恶化、骨量减少为特征，导致患者骨脆性及骨折的风险增加，通常导致患者生活质量下降[1-2]。尽管已经报道了许多导致OP的信号通路，但是仍然缺乏有效的治疗方法。已有研究表明氧化应激增加可能在骨丢失中起重要作用，并最终导致骨质疏松性骨折，在OP中发挥重要作用[3]。FoxO3a作为FOX家族重要成员，在OP发展过程中可通过调节Wnt信号通路在骨形成中发挥关键作用，同时参与氧化应激介导的OP发病[4]。骨疏方含有方中熟地、淫羊藿、丹参、黄芪等药物，以补肾壮骨、益气活血为组方原则，其中多种药物具有抗氧化应激作用，在骨质疏松防治中发挥作用[5-6]。因此推测骨疏方可以通过抗氧化应激机制，促进骨形成防治绝经后OP,鉴于FoxO/Wnt信号通路在调节骨形成中的关键作用，同时参与氧化应激介导的OP发病，故骨疏方的可能机制是通过调控FoxO/WntS信号通路参与抗氧化机制实现对OP的治疗。

1、材料与方法

1.1细胞来源

中国科学院(中国上海)细胞库提供MC3T3-E1细胞。将细胞培养于α-最低必需培养基(α-MEM)中，其中加入10%胎牛血清和青霉素-链霉素双抗性液体，每3 d更换一次细胞培养基。在细胞达到80%～90%汇合后，使用0.25%胰蛋白酶对细胞进行传代培养。

1.2骨疏方药液

武汉市中医医院药学基地中药标准化研究实验室提供骨疏方药液。具体炮制方法为：分别称取淫羊藿20 g,制熟地20 g,怀牛膝15 g,丹参20 g,补骨脂15 g,黄芪20 g,山茱萸10 g,鹿角胶20 g,生龙牡20 g,加入50%乙醇，浸泡1 h, 45℃下超声30 min,超声2次，合并药液，滤过，旋转蒸发仪减压浓缩至每1 mL含生药4 g, 4℃下保存备用。

1.3主要试剂与仪器

α-MEM培养基购自Hyclone公司；青霉素-链霉素双抗液体、CCK-8试剂盒、茜素红溶液均购自索宝莱科技有限公司；过氧化氢(H2O2)购自Sigma-Aldrich公司；超氧化物歧化酶(SOD)、RIPA裂解液、丙二醛(MDA)购自碧云天生物技术有限公司；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购自南京程健生物工程研究所；TRIzol试剂购自Invitrogen; BCA蛋白试剂盒购自Thermo Scientific; FoxO3a、Wnt2、β-连环蛋白(β-catenin)抗体购自Abcam公司；ELx800酶标仪购自BioTEK公司；转膜仪、凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.4 CCK-8检测细胞活力

在96孔板中接种1 000个细胞/孔，设置对照组(不作处理)、H2O2组以及不同浓度的骨疏方组。其中H2O2组150μmol/L H2O2处理MC3T3-E1细胞[7];不同浓度的骨疏方药液组分别在150μmol/L H2O2基础上，以0.01、0.1、1、10、100μmol/L骨疏方药液处理细胞，24 h后将10μL CCK-8溶液添加到每孔细胞中，并孵育1 h。随后使用在450 nm处测量吸光度，分析细胞活力大小。

1.5细胞分组及处理

以MC3T3-E1细胞为研究对象，分别设置对照组、H2O2组、骨疏方组、骨疏方+空载体(pcDNA3.1)组、骨疏方+FoxO3a过表达(pcDNA3.1-FoxO3a)组。其中H2O2组以150μmol/L H2O2处理MC3T3-E1细胞；骨疏方组以150μmol/L H2O2、1μmol/L处理MC3T3-E1细胞；骨疏方+空载体组、骨疏方+FoxO3a过表达组分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-FoxO3a, 48 h后以在150μmol/L H2O2、1μmol/L处理MC3T3-E1细胞。

1.6 CCK-8检测各组MC3T3-E1细胞活力

收集各组细胞，按照1.5中分组处理48 h,随后参照1.4操作检测各组细胞活力，实验重复3次，每次2个平行。

1.7 ELISA检测上清液中SOD、MDA的水平

收集各组细胞，按照1.5中分组处理48 h,离心取上清液，按照试剂盒要求检测SOD、MDA水平，实验重复3次，每次2个平行。

1.8 ALP试剂盒检测ALP活性

MC3T3-E1细胞在成骨诱导培养基(补充有10% FBS、50μg/mL抗坏血酸、10 mmol/Lβ-磷酸甘油和10 nmol/L地塞米松的α-MEM)中培养7 d,用冰冷的PBS洗涤，ALP活性试剂盒根据试剂盒说明将每组上清液用于定量分析ALP活性，实验重复3次，每次2个平行。

1.9茜素红分析细胞骨矿化结节

MC3T3-E1细胞在成骨诱导培养基(补充有10% FBS、50μg/mL抗坏血酸、10 mmol/Lβ-磷酸甘油和10 nmol/L地塞米松的α-MEM)中培养14 d,用PBS冲洗，用4%多聚甲醛固定，并用0.2%茜素红溶液染色，1 h后去除浮色，干燥并在显微镜拍照，并以bioquant osteo软件统计骨矿化结节数量。

1.10 qRT-PCR检测成骨相关基因OPN mRNA、Runx2 mRNA以及FoxO3a mRNA表达水平

收集各组细胞，按照1.5中分组处理48 h, TRIzol试剂从细胞中提取RNA,然后使用PrimeScript RT试剂盒将RNA逆转录成cDNA用于RT-PCR反应。实时荧光定量PCR试剂盒的反应条件为：37℃5 min、85℃5 s、4℃10 min,其中1μL cDNA,1μL引物，5μL SYBR Gree,并以不含核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶的水补足10μL体系。热循环条件如下：95℃变性15 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸1 min,循环40次，2-ΔΔCt分析OPN mRNA、Runx2 mRNA以及FoxO3a mRNA表达，以β-actin为内部参照物，实验重复3次，每次2个平行，引物序列见表1。

表1qRT-PCR引物序列

1.11 Western blot检测通路相关蛋白FoxO3a、Wnt2、β-catenin表达水平

收集各组细胞，按照1.5中分组处理48 h,用100μL RIPA裂解液提取各组细胞中的总蛋白并离心(12 000 r/min, 15 min),使用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，12% SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，硝酸纤维素膜用于蛋白质的转移，室温下用5%脱脂乳封闭膜。用1% TBST洗涤后，将膜与FoxO3a、Wnt2、β-catenin抗体在4℃孵育过夜，第2天与二抗在4℃孵育2 h,彻底洗涤后，用增强的化学发光系统包被蛋白质条带，并用化学发光成像系统可视化，蛋白质水平以β-actin为内参。最后使用Image J软件计算蛋白质相对表达水平，实验重复3次，每次2个平行。

1.12统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，进一步行SNK-q检验，结果以均数±标准差(x¯±s)

表示数据，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同浓度的骨疏方对MC3T3-E1细胞活力的影响

与对照组比较，H2O2组MC3T3-E1细胞活力显著降低(P<0.05);与H2O2组比较，0.1、1、10、100μmol/L骨疏方组MC3T3-E1细胞活力显著增加(P<0.05),0.01骨疏方组MC3T3-E1细胞活力差异无统计学意义(P>0.05),且1μmol/L骨疏方处理后，细胞活力接近50%,故以此浓度进行后续研究。见表2。

表2不同浓度的骨疏方对MC3T3-E1细胞活力的影响

2.2骨疏方对各组MC3T3-E1细胞活力的影响

与对照组比较，H2O2组细胞活力显著降低(P<0.05);与H2O2组比较，骨疏方组细胞活力显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较，骨疏方+FoxO3a过表达组细胞活力显著降低(P<0.05),见表3。

表3骨疏方对各组MC3T3-E1细胞活力的影响

2.3骨疏方对各组MC3T3-E1细胞MDA、SOD的影响

与对照组比较，H2O2组MDA显著增加，SOD显著降低(P<0.05);与H2O2组比较，骨疏方组MDA显著降低，SOD显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较，骨疏方+FoxO3a过表达组MDA显著增加，SOD显著降低(P<0.05),见表4。

表4各组MC3T3-E1细胞上清液中MDA、SOD的变化

2.4骨疏方对各组MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

与对照组比较，H2O2组ALP活性显著降低(P<0.05);与H2O2组比较，骨疏方组ALP活性显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较，骨疏方+FoxO3a过表达组ALP活性显著降低(P<0.05),见表5。

表5各组MC3T3-E1细胞ALP活性变化

2.5骨疏方对各组MC3T3-E1细胞骨矿化结节的影响

与对照组比较，H2O2组骨矿化结节数量显著降低(P<0.05);与H2O2组比较，骨疏方组骨矿化结节数量显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较，骨疏方+FoxO3a过表达组骨矿化结节数量显著降低(P<0.05),见图1、表6。

图1观察各组MC3T3-E1细胞骨矿化结节变化(×400)

表6各组MC3T3-E1细胞骨矿化结节变化

2.6骨疏方对各组MC3T3-E1细胞FoxO3a mRNA、OPN mRNA、Runx2 mRNA表达的影响

与对照组比较，H2O2组FoxO3a mRNA表达显著增加，OPN mRNA、Runx2 mRNA表达显著降低(P<0.05);与H2O2组比较，骨疏方组FoxO3a mRNA表达显著降低，OPN、Runx2 mRNA表达显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较，骨疏方+FoxO3a过表达组FoxO3a mRNA表达显著增加，OPN、Runx2 mRNA表达显著降低(P<0.05),见表7。

表7各组MC3T3-E1细胞FoxO3a、OPN、Runx2 mRNA表达水平

2.7骨疏方对各组MC3T3-E1细胞FoxO3a、Wnt2、β-catenin表达的影响

与对照组比较，H2O2组FoxO3a表达显著增加，Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05);与H2O2组比较，骨疏方组FoxO3a表达显著降低，Wnt2、β-catenin表达显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较，骨疏方+FoxO3a过表达组FoxO3a表达显著增加，Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05),见图2、表8。

图2各组MC3T3-E1细胞中FoxO3a、Wnt2、β-catenin蛋白表达(Western blot图)

表8各组MC3T3-E1细胞FoxO3a、Wnt2、β-catenin蛋白表达水平

3、讨论

OP是一种常见的代谢疾病，涉及骨密度降低、骨微结构破坏和骨脆性增加[8]。研究证明成骨细胞对于骨的形成和重塑非常重要[9]。抗氧化防御屏障的破坏可通过脂质过氧化、成骨细胞凋亡和骨吸收导致骨丢失，引发骨质疏松症[10]。H2O2作为诱导氧化应激发生的分子，可诱导自由基的自生并产生广泛的损伤，包括成骨细胞在内的各种类型的细胞凋亡、坏死，已广泛用于研究OP的发病机理[11]。故本研究以H2O2诱导MC3T3-E1细胞构建成骨细胞损伤模型，以探讨骨疏方的作用效果及相关机制。

OP的治疗集中于成骨细胞和破骨细胞，例如双膦酸盐抑制骨吸收；特立帕肽促进骨形成，但患者的状况不稳定，并且在停药后复发[12-13]。因此在深入研究和发掘化学合成药物的同时，更应注重天然植物化合物的开发应用。近年来中医药治疗OP的机制研究取得了重大进展，可通过调节内分泌使细胞和体液免疫功能增强，防止氧自由基的过量产生，增强骨抗压缩、抗弯曲能力，增加骨密度，改善和修复骨小梁显微结构，从而达到防治OP的目的，且具有毒副作用小等优势，说明中医药治疗OP具有广阔的前景[14]。骨疏方主要成分有熟地、淫羊藿、丹参、黄芪等，均具有抗氧化应激作用及抗骨质疏松作用[5-6,15-16]。本研究发现H2O2诱导的MC3T3-E1细胞中，ALP活性、骨矿化结节数量降低，OPN mRNA、Runx2 mRNA表达下调，提示H2O2成功诱导MC3T3-E1细胞损伤。进一步结果显示细胞活力下降，MDA水平增加，SOD降低，表明氧化应激参与OP进展[17]。但经骨疏方处理后，提高了MC3T3-E1细胞活力，氧化应激水平降低，ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA表达均增加，表明骨疏方可通过抗氧化应激作用发挥治疗OP的作用，但其机制尚不明确。

Wnt/β-catenin信号在控制成骨的主要过程中发挥重要作用，其促进成骨细胞分化和矿化，参与OP发展[18]。FoxO转录因子是影响成骨细胞氧化还原平衡和骨稳态的关键因素，其中FoxO3a在骨和骨细胞中普遍存在，并且表达水平较高，可通过刺激自由基清除等功能基因的表达，构建以FoxO3a为中心的氧化应激体系，激活其表达可通过抑制Wnt/β-catenin通路在OP的发生发展中发挥作用[19-20]。本研究发现H2O2诱导MC3T3-E1细胞中，FoxO3a表达显著增加，Wnt2、β-catenin表达降低，提示OP的发生可能与上调FoxO3a表达、抑制Wnt2、β-catenin表达有关。但经骨疏方处理后，可显著降低FoxO3a表达，提高Wnt2、β-catenin表达，减轻H2O2诱导MC3T3-E1细胞损伤，提示骨疏方可能通过抑制FoxO3a表达进而促进Wnt2、β-catenin表达减轻H2O2诱导的MC3T3-E1细胞损伤。为进一步验证该机制，实验以pcDNA3.1-FoxO3a进行转染细胞，结果发现pcDNA3.1-FoxO3a逆转了骨疏方对H2O2诱导MC3T3-E1细胞的保护作用，表明骨疏方减轻H2O2诱导MC3T3-E1细胞损伤，可能通过抑制FoxO3a/Wnt信号通路实现。

综上所述，骨疏方可改善H2O2诱导成骨细胞损伤，抑制氧化应激反应，可能与抑制FoxO3a/Wnt信号通路有关，但由于中药作用靶点较多，后续将对作用机制深入探讨。

参考文献:

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[4]张富财,郑峰,王福荣,等.丹皮酚对去卵巢骨质疏松大鼠叉头框蛋白O3a/Wnt信号通路及椎骨密度的影响[J].中国组织工程研究,2021,25(32):5091-5096.

[5]刘谊民,许婷,张黄琴,等.基于谱效关系和网络药理学的淫羊藿抗骨质疏松物质基础及作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(16):177-184.

[6]李媛美,郭帅,张欣怡,等.基于网络药理学及分子对接探讨黄芪治疗骨质疏松症的分子机制及实验验证[J].中国医药导报,2023,20(13):29-32.

[7]季泽娟,张春旭,郭占豪,等.竹叶总黄酮通过抑制Nox4减轻H2O2诱导的成骨细胞氧化损伤[J].实用药物与临床,2018,21(3):246-251.

基金资助:武汉市医学科研项目(WZ19C17);

文章来源:段波,陈丽川,马志毅,等.骨疏方调节FoxO3a/Wnt信号通路对H2O2诱导成骨细胞损伤的影响[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(10):1426-1431.