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医疗器械血液学检测中人血与兔血介质的比较研究

2024-09-24 68 上传者：管理员

摘要：目的：对比兔血和人血2种血液的全血计数试验结果，探讨以兔血替代人血进行医疗器械血液学检测的可行性。方法：参考GB/T 16886.4—2022《医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择》和ASTM F2888-13Standard test method for platelet leukocyte count—an in-vitro measure for hemocompatibility assessment of cardiovascular materials，选择高密度聚乙烯、黑橡胶、玻璃珠、活性炭、天然橡胶、丁腈橡胶、高硼硅纤维滤纸、一次性使用真空瓶、一次性介入导管鞘套件、一次性使用输血器、血液透析器、体外循环血路12种医疗器械或材料，在同一试验条件下，分别以兔血和人血作为浸提介质，采用全自动血细胞分析仪测定WBC计数值和RBC计数值。结果：活性炭的WBC计数值和RBC计数值与空白对照相比的百分数均小于50%，其他医疗器械或材料的WBC计数值和RBC计数值与空白对照相比的百分数均大于50%。兔全血和人全血的全血细胞计数试验结果具有一致性。结论：在人血获取困难时，兔血可作为一种理想的血液来源应用于医疗器械的血液学检测。

关键词：
人血
兔血
全血细胞计数试验
医疗器械
血液学检测
血液相容性
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伴随着医疗技术不断发展，许多新型生物材料和高端医疗器械在临床被广泛应用，例如人工心脏、主动脉内球囊反搏导管套件、人工心脏瓣膜、血液透析器、介入导管鞘、腔静脉滤器等，这些医疗器械的使用可以提升患者的生活质量，延长患者的寿命。这类医疗器械在临床使用中均属于与循环血液相接触的器械，在临床使用时应满足基本要求：与血液接触后要具有较好的血液相容性，从而降低材料或医疗器械对患者造成的不良反应[1]。因此与血液接触的生物材料或医疗器械在临床使用之前必须进行血液相容性方面的检测和评价。本文拟使用2种生物血液（兔血和人血）初步建立血液学（全血细胞计数）检测方法，同时选择GB/T 16886.4—2022《医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择》[2]中需要进行血液学试验的样品（主要为外部接入器械的血液贮存和输注设备、血液采集器械、置入时间短于24 h的导管、血液透析/过滤器等）开展全血计数试验，探讨兔血替代人血进行血液学检测的可行性。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1全血来源

兔血采集于健康成年的新西兰家兔[来源：南京市浦口区莱芙养殖场，许可证号：SCXK（苏）2019-0005]，饲养条件：温度为21～26℃、相对湿度为40%～70%，换气次数≥8次/h,12 h光照12 h黑暗，实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2021-006。人全血由健康的成年志愿者提供（男性，年龄为18～40岁，试验开展前在三甲医院体检血常规均在正常参考值范围）。

于健康志愿者体内采集的新鲜抗凝人全血（采集4 h内），红细胞（red blood cell,RBC）计数值应在3.5×1012/L～5.5×1012/L，白细胞（white blood cell,WBC）计数值应在4.0×109/L～10.0×109/L内，混合后颠倒混匀，置于冰上保存备用。于健康家兔体内采集的新鲜抗凝兔全血（采集4 h内），混匀后置于冰上保存备用。

1.1.2试剂耗材

采用聚丙烯试管、一次性使用真空采血管（3.2%的枸橼酸钠）、一次性使用采血针、一次性使用注射器、移液器和移液器枪尖等相关试验耗材。

ASTM F2888—2013 Standard test method for platelet leukocyte count—An in-vitro measure for hemocompatibility assessment of cardiovascular materials[3]标准中推荐黑橡胶和天然橡胶作为阳性对照材料，高密度聚乙烯作为阴性对照材料，YY/T 1649.1—2019《医疗器械与血小板相互作用试验第1部分：体外血小板计数法》[4]增加了玻璃珠和丁腈橡胶作为阳性对照材料。另外考虑需要同时对RBC和WBC具有吸附作用，选择吸附能力强的活性炭和高硼硅纤维滤纸。活性炭具有比表面积大、孔径结构丰富多样、容量大等结构特征，且具备较好的吸附性[5]。高硼硅纤维滤纸可吸附液体、机械强度高。因此本文选择黑橡胶、玻璃珠、活性炭、天然橡胶、丁腈橡胶、高硼硅纤维滤纸作为阳性对照材料，高密度聚乙烯作为阴性对照材料。

根据GB/T 16886.4—2022，本文选择一次性使用输血器、一次性使用真空瓶、一次性介入导管鞘套件、血液透析器、体外循环血路共5种与血液接触的三类医疗器械作为探讨兔血替代人血可行性的检测对象。其中一次性输血器属于血液输注设备，一次性使用真空瓶属于血液贮存设备，体外循环血路属于心肺转流器具，一次性介入导管鞘套件属于置入时间短于24 h的导管，血液过滤器属于血液透析/过滤器。

1.1.3仪器设备

本文所用仪器设备包括恒温振荡器（培英，型号：THZ-C）、低温高速离心机（SIGMA，型号：Sigma4-88）、全自动动物血液分析仪（希森美康，型号：XN-1000V）、全自动血细胞分析仪（贝克曼，型号：Ac.T5diff）等。

1.2方法

1.2.1样品制备

根据浸提介质不同分为人全血浸提液组和兔全血浸提液组，均包括组别1～组别13，每组设3个平行管。将材料分别置于聚丙烯塑料试管中，剪成小块，保证最大程度地与试验介质接触，每管中加入适量试验介质；空白对照在同样条件下制备。将制备好的样品放入聚丙烯材质的试管中，具体如下：（1）组别1：空白对照，同批号聚丙烯塑料管，不添加医疗器械或材料。（2）组别2：高密度聚乙烯，制备成0.5 cm×2.0 cm的小片，按6 cm2/m L的浸提比例加入全血。（3）组别3：黑橡胶，按6 cm2/mL的浸提比例加入全血。（4）组别4：玻璃珠，按6 cm2/mL的浸提比例加入全血。（5）组别5：活性炭，按6 cm2/m L的浸提比例加入全血。（6）组别6：天然橡胶，制备成0.5 cm×2.0 cm的小片，按6 cm2/m L的浸提比例加入全血。（7）组别7：丁腈橡胶，制备成0.5 cm×2 cm的小片，按6 cm2/mL的浸提比例加入全血。（8）组别8：高硼硅纤维滤纸，制备成0.5 cm×2.0 cm的小片，按6 cm2/mL的浸提比例加入全血。（9）组别9：一次性使用输血器，制备成约2.0 cm的小段，按0.2 g/m L的浸提比例加入全血。（10）组别10：一次性使用真空瓶，按3 cm2/mL的浸提比例加入全血。（11）组别11：一次性介入导管鞘套件，取导管鞘和扩张器，制备成约2.0 cm的小段，按0.2 g/mL的浸提比例加入全血。（12）组别12：血液透析器，取中空纤维，制备成0.5 cm×2.0 cm的小片，按6 cm2/mL的浸提比例加入全血。（13）组别13：体外循环血路，制备成约2.0 cm的小段，按0.2 g/mL的浸提比例加入全血。

1.2.2试验方法

所有试管轻轻混匀后放进恒温振荡器中，在（37±1）℃、（1±0.1)h条件下振荡孵育，振荡速率为60 r/min。孵育完成后将每个试管中加入0.01 m L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA），其浓度到5 mmol/L时反应停止。将所有试管置于冰浴中，并立即转移试验介质至预先冰浴的新试管中，提前打开全自动分析仪预热10 min。人全血浸提液组用全自动血细胞分析仪检测各管的RBC和WBC计数值；兔全血浸提液组用全自动动物血液分析仪检测各管的RBC和WBC计数值。

1.2.3数据分析

参考ASTM F2888—13标准中的方法，计算所有组别的WBC和RBC计数值的平均值和标准差。计算每组与空白对照的百分比C公式如下：

式中，A为试验样品的WBC和RBC平均值；B为空白对照的WBC和RBC平均值。

每组3管全血的WBC和RBC计数值必须在平均值的±20%范围内，否则重新进行试验。

2、结果

人全血浸提液组试验结果显示，黑橡胶、玻璃珠、活性炭、天然橡胶、丁腈橡胶和高硼硅纤维滤纸的WBC计数值与空白对照的百分比均小于80%，其中活性炭的WBC计数值与空白对照的百分比小于50%，其他材料均大于50%；活性炭的RBC计数值与空白对照的百分比小于50%，其他组别材料的RBC计数值与空白对照的百分比均大于80%，详见表1。兔全血浸提液组试验结果显示，黑橡胶、天然橡胶和丁腈橡胶的WBC计数值与空白对照的百分比均大于80%，玻璃珠、活性炭和高硼硅纤维滤纸的WBC计数值与空白对照的百分比均小于80%，其中仅活性炭的WBC计数值与空白对照的百分比小于50%；活性炭的RBC计数值与空白对照的百分比小于50%，其他组别材料的RBC计数值与空白对照的百分比均大于80%，详见表2。

参考YY/T 1649.1—2019和ASTM F2888—2013中的试验有效性要求，阳性对照材料数值与空白对照相比百分数应小于50%，阴性对照材料数值与空白对照相比百分数应在80%～120%内。同时，不同血液浸提组的组别9～组别13的WBC和RBC计数值与空白对照的百分比均在80%～120%范围内，结果具有一致性。

表1人全血浸提液组试验结果

表2兔全血浸提液组试验结果

3、讨论

GB/T 16886.4—2022中提到由于不同生物间血液反应的差异性，优先推荐人血作为首选介质开展血液学试验。但是临床治疗用血都面临短缺的危机，科研用血的获取尤为紧缺，使用成本较高，使得医疗器械进行血液学（全血细胞计数）评价时，人体供血用于检测更加困难。而且人体供血存在很多不确定因素，志愿者可能会携带某些传染性病毒、体内有炎症或者存在某些难以察觉的基础病，不经过检验直接使用存在风险。采用人血开展试验时要求使用新鲜抗凝的全血，一般需要在采集4 h内完成检测，因此在常规检验工作中长期批量使用新鲜的抗凝人血相当困难。为了开展医疗器械的血液相容性试验，在GB/T 16886.4—2022中提到健康家兔与人类的RBC溶血特性较相近，医疗器械生物学评价系列标准中也常使用家兔开展试验，比如皮内反应、动物刺激试验、直肠刺激和溶血试验。家兔具有稳定的种属来源，容易获取，血液成分稳定，经过养殖场检疫合格并发放合格证才会流通。既往有关于兔血浆应用于部分凝血活酶时间试验来评价医疗器械促凝活性的研究[6]，以及家兔血液应用于医疗器械血液相容性评价的可行性研究[7]。

2023年5月1日实施的GB/T 16886.4—2022对比旧版GB/T 16886.4—2003发生了很大变动[8]，尤其是增加了用于评估与血液相互作用的常用试验表格。常用试验表格中推荐了溶血试验、体内血栓试验和体外血栓形成试验（凝血、血小板激活、血液学和补体）等具体检测项目，其中溶血试验、体内血栓和体外形成血栓试验目前都已发布相关的行业标准或方法补充[9-11]，仅血液学试验无相关的行业标准或方法补充。血液学试验中首次提到了全血细胞计数方法，该试验用于测定全血中WBC计数值和RBC计数值，为器械/材料与血液成分接触过程的相互影响提供了参考。

另外，相关研究报道检测实验动物血宜采用动物专用血液检测仪[12]，考虑动物血液与人体血液的区别，本次试验针对不同种属的血液来源首次进行全血计数检测时，选择人血用的全自动血细胞分析仪和动物血用的全自动动物血液分析仪分别开展试验，希森美康的全自动动物血液分析仪测定WBC计数值的原理是核酸荧光染色，RBC计数值测定原理是电阻法；贝克曼的全自动血液分析仪测定WBC计数值和RBC计数值原理均为电阻法。本试验中一次性使用真空瓶、一次性介入导管鞘套件、一次性使用输血器、血液透析器和体外循环血路共5种与血液接触的三类医疗器械的人血和兔血试验结果显示，人血和兔血的全血计数结果具有一致性。

综上所述，基于ASTM F2888—13试验方法，本次研究初步建立了全血细胞计数的检测方法，同时探讨兔血替代人血的可行性，为医疗器械血液相容性常规检验工作提供了可行性参考。在人血获取困难时，兔血可替代人血应用于全血细胞计数试验以评价医疗器械的血液相容性。局限于人血的来源和医疗器械产品的复杂性，本研究的器械或材料和数据还不够全面，比如研究对象未涉及置入时间大于24 h的导管、WBC分离器和经皮循环支持设备等需要开展血液学检测项目的医疗器械。下一步考虑增加试验样品种类，筛选其他的阳性对照材料，进一步验证试验体系的有效性，同时开展血液学检测试验中WBC激活试验。

参考文献:

[1]严拓,闫维君.肝素涂层在血液接触医疗器械中的应用现状[J].中国医疗器械杂志,2023,47(3):288-293.

[2]医疗器械生物学评价第4部分:与血液相互作用试验选择:GB/T 16886.4—2022[S].

[4]医疗器械与血小板相互作用试验第1部分:体外血小板计数法:YY/T 1649.1—2019[S].

[5]徐爱武,梁燕,李翼然.活性炭纤维的特性､发展及应用[J].纺织科技进展,2023(2):6-10.

[6]杨文润,莫晓彦,颜林,等.兔血浆应用于部分凝血活酶时间(PTT)试验以评价医疗器械促凝活性的研究[J].中国医疗器械信息,2020,26(1):24-26.

[7]杨文润,田胜慧,柯军.家兔血液应用于医疗器械血液相容性评价的可行性研究[J].中国医疗器械信息,2016,22(13):41-45.

[8]侯丽,乔春霞,赵增琳.解读ISO 10993-4:2017《医疗器械生物学评价第4部分:与血液相互作用试验选择》[J].中国医疗设备,2018,33(11):1-6.

[9]医疗器械溶血试验第1部分:材料介导的溶血试验:YY/T 1651.1—2019[S].

[10]医疗器械补体激活试验第3部分:补体激活产物(C3a和SC5b-9)的测定:YY/T 0878.3—2019[S].

[11]医疗器械血栓形成试验第1部分:犬体内血栓形成试验:YY/T 1770.1.3—2021[S].

[12]牛子鹏,冯小明,郭晓宇.不同血液检测仪对实验动物血液的检测结果对比分析[J].西北国防医学杂志,2020,41(7):418-421.