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高效液相色谱法测定注射用盐酸石蒜碱硫酯含量

2024-10-10 57 上传者：管理员

摘要：目的:基于高效液相色谱（HPLC）法开发一种注射用盐酸石蒜碱硫酯的含量测定方法。方法:色谱柱Kromasil(C18,4.6 mm×250 mm, 5μm);流动相为甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾（氢氧化钾调节pH至8.0）(80∶20);流速1.0 mL/min;检测波长290 nm;进样量10μL;柱温25℃。结果:经实验研究结果证明在该方法下，盐酸石蒜碱硫酯在0.08～0.32 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系（r=0.999 8）,平均回收率为99.7%,相对标准偏差（RSD）为0.9%（n=9）。用该方法对10个批次的自制品进行含量测定，结果均在98.0%～102.0%范围内。结论:本研究建立的方法具有简便、准确且重现性好等优点，可实现快速测定注射用盐酸石蒜碱硫脂的含量，以满足制剂大批量样品质量控制需求。

关键词：
EV-A71
手足口病
盐酸石蒜碱硫酯
肠道病毒71型
高效液相色谱
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手足口病是一种发疹性传染病，主要由小核糖核酸病毒科肠道病毒属的柯萨奇病毒A16(coxsackievirus A16,CVA16)和肠道病毒71型(enterovirus A71,EV-A71)引起[1-2]。该病多发于儿童，主要表现为口腔和四肢末端的斑丘疹、疱疹，症状多轻微且具有自愈性，大多数患儿可在一周左右结束病程[3-4],然而少数重症患儿若没有得到及时的治疗，可能会出现脑炎、心肌炎、肺水肿和循环障碍等疾病，严重者甚至会引起器官损伤[5-6]。临床尚无特别有效的药物用于CVA16和EV-A71感染的预防和治疗，因此急需研发安全有效的抗病毒药物用于手足口病的防治。

盐酸石蒜碱是从石蒜碱科植物石蒜的鳞茎中提取的一种异喹啉类生物碱，不仅具有消炎、抗病毒、抗肝纤维化、保护心血管以及抗真菌等多种药理作用[7-9],还对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，并且对哺乳动物的细胞具有较低的毒性，因此被认为是一种潜在的抗癌药物[10]。盐酸石蒜碱硫酯为盐酸石蒜碱的前体药物，化学名为(1S,2S)-2-羟基-2,3a1,4,5,7,12b-六氢-1H-[1,3]二氧杂戊环[4,5-j]吡咯[3,2,1-de]非啶-1-基2-((4-氟苯基)硫)乙酸盐酸盐，分子式为C24H23ClFNO5S,相对分子量为491.96。其在体内分解成盐酸石蒜碱和对氟苯硫乙酸，在体外可以对CVA16和EV-A71感染具有很好的治疗作用，动物实验表明盐酸石蒜碱硫酯对EV-A71感染的小鼠具有很好的保护作用[11-12],然而目前国内外未见有对其含量测定方法的报道。本研究建立高效液相色谱(HPLC)法测定注射用盐酸石蒜碱硫酯含量，为提高对注射用盐酸石蒜碱硫酯的生产质量提供参考。

1、仪器与试药

高效液相色谱仪(Acquity Arc, Waters);分析天平(MSA125P-CE,德国赛多利斯公司);分析天平(MSA224S-CE,德国赛多利斯公司);分析天平(SQP,德国赛多利斯公司);pH计(Seven Easy, 瑞士梅特勒-托利多公司)。

注射用盐酸石蒜碱硫酯(批号220301、220302、220303、220701、220702、220703、220801、220901、220902、220903)来源均为自制；空白辅料来源为自制；盐酸石蒜碱硫酯对照品来源为自制；甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾、氢氧化钾均为分析纯；水为纯化水。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil(C18,4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相：甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾(氢氧化钾调节pH至8.0)(80∶20);检测波长：290 nm; 柱温：25 ℃;流速：1.0 ml/min; 进样量：10 μL。

2.2 溶液的配制

空白溶剂：80%甲醇水溶液。对照品溶液：取盐酸石蒜碱硫酯对照品约20 mg, 精密称定，置100 mL容量瓶中，加空白溶剂溶解并定容，混匀即得。供试品溶液：取本品10支，加适量水溶解，置50 mL容量瓶中，加水分次洗涤西林瓶，将洗涤液转移至容量瓶中，加水定容，摇匀；量取5 mL,置25 mL容量瓶中，加空白溶剂定容，摇匀。

精密量取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1、图2),按外标法计算盐酸石蒜碱硫酯的含量。

图1 对照品溶液色谱图

图2 供试品溶液色谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系考察

精密称取盐酸石蒜碱硫酯对照品适量，加空白溶剂溶解并稀释制成系列溶液。分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果在0.08～0.32 mg/mL浓度范围内线性方程为Y=5 928 987.942 6X-8 413.200 0,相关系数r为0.999 8,具有良好的线性关系。

2.3.2 重复性实验

取供试品，平行6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，测得盐酸石蒜碱硫酯峰面积相对标准偏差(RSD)为0.5%(n=6),表明方法重复性良好。

2.3.3 加样回收率实验

通过在空白辅料中加入规定限度的70%、100%、130%三个不同浓度的盐酸石蒜碱硫酯对照品溶液，再计算加样样品中盐酸石蒜碱硫酯的测定结果和理论值之间的比值(回收率),用百分比表示。结果显示，9份样品的回收率在98.6%～101.8%,RSD为0.9%,方法具有良好的加样回收率，见表1。

表1 加样回收率实验

2.3.4 溶液稳定性实验

取供试品和对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，测得盐酸石蒜碱硫酯供试品溶液和对照品溶液，24 h峰面积RSD分别为0.2%、0.2%(n=9),表明溶液稳定性良好。

2.3.5 耐用性实验

通过改变流速、柱温、pH值、更换不同序列号色谱柱来评估测定条件有微小变动时，测定结果受影响的耐受程度。结果显示，色谱条件微小变动时，盐酸石蒜碱硫酯含量测定结果与原有条件基本一致，含量偏差均<2.0%,符合要求，说明方法耐用性良好，见表2。

表2 耐用性实验结果

2.3.6 样品含量测定

对10个批次的制剂进行检测，样品含量均在90%～110%范围内，见表3。

表3 样品含量测定结果

3、讨论

3.1 色谱条件优化

使用二极管阵列检测器检测在200～400 nm范围内进行紫外吸收全波长扫描，结果盐酸石蒜碱硫酯在290 nm处有最大吸收，且在该条件下，分离度符合要求，因此选择290 nm作为检测波长。

首先，考察了不同比例甲醇-水50∶50、60∶40、70∶30、80∶20作为流动相等度洗脱，甲醇比例>70%时，出峰时间<10 min, 但进样量过多会导致盐酸石蒜碱硫酯峰形变差，重现性差。然后，考虑在水相中加入0.1%三氟乙酸、0.005 mol/L磷酸盐缓冲液、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液、0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，结果发现盐酸石蒜碱硫酯色谱峰前延且拖尾因子不满足要求。最后，考察不同pH值盐溶液对峰形的影响，以甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾(pH 8.0)、甲醇-0.005 mol/L磷酸二氢钾(pH 5.0)、甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾(pH 2.5)作为流动相等度洗脱，结果发现以甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾(pH 8.0)缓冲液作为流动相等度洗脱时，主峰峰形较好，出峰时间(5 min)较短，且方法重现性良好。故最终选择甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾(pH 8.0)缓冲液作为流动相。

配制样品浓度为0.2 mg/mL,分别进样5、10、20 μL,发现当样品进样10 μL时，色谱峰峰高合适，确定供试品配制浓度为0.2 mg/mL,进样量10 μL。

3.2 前处理方法优化

分别用不同浓度的甲醇水溶液(0%～80%)溶解盐酸石蒜碱硫酯对照品，发现含量无明显变化，考虑到流动相的溶剂效应，故选择80%甲醇作为空白溶剂。

4、小结

本试验建立了一种HPLC法测定注射用盐酸石蒜碱硫酯含量的方法，获得了较好实验效果，通过方法学考察表明，该方法具有操作简便、准确度高、稳定性强等特点，适用于注射用盐酸石蒜碱硫酯的质量控制。

参考文献:

[1]郝晓甜,李克坚,周诚,等.柯萨奇病毒A组6型的研究进展[J].中国生物制品学杂志,2023,36(10):1271-1275.

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[4]陈月,许红梅.柯萨奇病毒A16型感染引起手足口病的研究进展[J].儿科药学杂志,2020,26(1):53-56.

[5]崔博沛,毛群颖,梁争论.柯萨奇病毒A组10型研究进展[J].微生物学免疫学进展,2018,46(2):63-67.

[6]龚雪萍,谢中勇.影响重症肠道病毒71型感染手足口病患儿并发脑炎的相关因素回归分析[J].黑龙江医学,2023,47(18):2185-2188.

[7]黄霜.盐酸石蒜碱对甲状腺乳头状癌的抑制作用及机制[D].江苏镇江:江苏大学,2022.