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UPLC-MSMS法测定对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯的含量

2020-12-03 856 上传者：管理员

摘要：目的：采用衍生化方法，建立超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用方法(UPLC-MS/MS)测定对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中基因毒性杂质对甲苯磺酰氯的含量。方法：采用AgilentEclipsePlusC18(2.1mm×50mm,1.8μm)色谱柱，以0.1%甲酸溶液-乙腈(50∶50)为流动相，流速为0.4mL•min-1。以0.3%苯胺乙腈溶液为衍生化试剂，对对甲苯磺酰氯进行衍生化前处理。在质谱电喷雾(ESI)正离子模式下检测，采用多反应监测(MRM)扫描模式，选择m/z248.1→93.2作为定量离子对，m/z248.1→156.1作为定性离子对。结果：对甲苯磺酰氯在0.18～360.0ng•mL-1范围内线性关系良好，r=0.9998；检测下限为0.06ng•mL-1，定量下限为0.18ng•mL-1；低、中、高浓度平均回收率分别为96.4%、97.0%、95.5%,RSD分别为0.75%、0.32%、0.57%(n=3);3批样品中对甲苯磺酰氯的含量分别为0.09、0.55、1.19ng•mg-1。结论：该方法准确可靠，可用于对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯的含量检测。

关键词：
基因毒性杂质
对甲苯磺酰氯
检验医学
药剂学
衍生化法
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对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯在制药过程中是一种很重要的中间体[1]，而对甲苯磺酰氯（图1）是合成对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯的主要原料。根据欧洲药事管理局相关指南[2]和ICHM7指导原则[3]，对甲苯磺酰氯是具有警示结构的基因毒性杂质。基于“避免-控制-清除”策略[4,5]，如不能把基因毒性杂质的引入放在离最终产物4步以外，就需要在每一步生产过程中分析工艺的清除能力，否则，对于终产品会有较大安全风险且加剧终产品的质量控制难度，因此，有必要建立对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯的含量检测方法，从而降低后续中间体或终产品的方法开发难度。目前检测对甲苯磺酰氯常用的分析方法包括气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC)[6,7,8,9,10,11]，对甲苯磺酰氯在中间体中含量微小，因此采用液质联用技术，其高灵敏度、快速分析、结果准确的特点可以满足本实验中对甲苯磺酰氯痕量检测。同时酰氯的性质活泼，具有很高的反应活性，直接分析检测往往会产生很大的误差，故采用化学衍生化结合液质联用技术的方法对酰氯化合物进行测定。根据衍生化试剂的不同，酰氯化合物的衍生化法主要分为水解法、酯化法和胺解法[12,13]。但因在水解法中，对甲苯磺酰氯与水发生水解反应生成对甲苯磺酸，同时对甲苯磺酸为对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中的主要工艺杂质，原有的对甲苯磺酸会对测定结果产生干扰；酯化法中的醇类试剂会和对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯发生酯交换，所产生的对甲苯磺酸酯同样会干扰酯化后的对甲苯磺酰氯的测定。查阅文献可知，胺基的存在会使氯原子被胺基取代形成酰胺[14]（图2），因此胺解法同样可以作为衍生化前处理方法。综上所述，本研究旨在开发一种用苯胺衍生前处理并结合液质联用的方法，精密测定对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯的含量，以控制对甲苯磺酰氯在对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯的残留量。

图1对甲苯磺酰氯化学结构

图2对甲苯磺酰氯衍生过程

1、仪器与试药

Agilent1290超高效液相色谱仪，安捷伦公司；Agilent6470三重四级杆质谱仪，配置喷射流离子聚焦技术（JetStream）的AJSESI源，安捷伦公司；质谱软件为MassHunterB.08.00工作站；XS205电子天平，梅特勒托利多公司；Milli-Q纯水仪，Millipore公司。AgilentEclipsePlusC18色谱柱（2.1mm×50mm,1.8μm），安捷伦公司。

对甲苯磺酰氯对照品（99%，批号BCBW7589),Sigma公司；对甲苯磺酸（98%，批号KBCHL426),INNOCHEM公司；对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯（批号：D170601、D170601R、D171001），山东绿叶制药有限公司；2,4-二硝基苯肼（批号20160629）、苯胺（批号20150415）均来自国药集团化学试剂有限公司；甲酸、乙腈均为色谱级，默克公司。

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：AgilentEclipsePlusC18RRHD(2.1mm×50mm,1.8μm）；流速：0.4mL·min-1；柱温：40℃；进样量：10μL;0.1%甲酸溶液-乙腈（50∶50）为流动相；运行时间：3.5min；对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯大约在2.4min时出峰，因此供试品测定时在0.8～2.3min切入到质谱检测，避免高浓度时对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯进入质谱。

2.2质谱条件

根据对甲苯磺酰氯衍生后生成对甲苯磺酰胺的化学性质，采用正离子模式检测。离子源参数：干燥气温度：350℃；干燥气流速：13L·min-1；雾化气压力：310kPa；鞘气温度：400℃；鞘气流速：12L·min-1；毛细管电压：6.0kV；喷嘴电压：2.0kV。一级质谱总离子流图（TIC）如图3所示，离子m/z248.1为[M+H]+。

图3对甲苯磺酰胺正离子模式下离子流图

对甲苯磺酰氯衍生物正离子模式下二级图谱如图4所示，主要碎片离子有m/z93.2和m/z156.1。二级质谱参数优化结果为：碎裂电压95V，碰撞能量15V，碰撞池加速电压3V。其2个离子对分别为m/z248.1→93.2和m/z248.1→156.1，由于离子对m/z248.1→93.2的响应比离子对m/z248.1→156.1的高，因此，选择m/z248.1→93.2作为定量离子对，m/z248.1→156.1作为定性离子对。

图4对甲苯磺酰胺正离子模式下子离子扫描

2.3溶液制备

2.3.1衍生化试剂

移取苯胺0.6mL至200mL量瓶，加乙腈稀释成0.3%衍生化试剂。

2.3.2对甲苯磺酸衍生溶液

精密称取对甲苯磺酸适量，加入乙腈溶解稀释成0.1×10-6ng·mL-1，取上述溶液1.0mL于25mL量瓶中，加入衍生化试剂12mL，室温下衍生10min，用纯水稀释至刻度，得4.0×10-3ng·mL-1对甲苯磺酸衍生溶液。

2.3.3对甲苯磺酰氯对照品储备液

精密称取对甲苯磺酰氯适量，加乙腈溶解并稀释成4.5×10-3ng·mL-1的对甲苯磺酰氯对照品储备液。

2.3.4对甲苯磺酰氯对照品衍生溶液

取对甲苯磺酰氯对照品储备液1.0mL，于25mL量瓶中，加入衍生化试剂12mL，室温下衍生10min，用纯水稀释至刻度，得180ng·mL-1的对甲苯磺酰氯对照品衍生溶液。

2.3.5供试品衍生溶液

精密称取对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯50mg，于25mL量瓶中，加入衍生化试剂12mL，室温下超声（53kHz,350W)2min使其完全溶解，室温下衍生10min，用纯水稀释成2mg·mL-1的供试品衍生溶液。

2.4方法学考察

2.4.1专属性

取空白衍生溶液、对甲苯磺酸衍生溶液、供试品衍生溶液、对甲苯磺酰氯对照品衍生溶液，按上述条件进行试验。如图5所示，空白衍生溶液、对甲苯磺酸衍生溶液对对甲基苯磺酰氯的测定无干扰，表示该方法专属性良好。

图5方法专属性考察

2.4.2线性范围、检测下限和定量下限

精密量取对甲苯磺酰氯储备液适量，分别稀释得到系列标准溶液储备液1～8，质量浓度分别为4.5、45、450、1350、2250、4500、6750、9000ng·mL-1，分别取系列标准溶液储备液1～81.0mL，于25mL量瓶中，加入衍生化试剂12mL，室温下衍生10min后，纯水定容，得到质量浓度分别为0.18、1.80、18.0、54.0、90.0、180.0、270.0、360.0ng·mL-1的系列标准溶液，进样分析，绘制标准曲线并得到回归方程：

（公式）

结果表明，对甲苯磺酰氯在0.18～360.0ng·mL-1范围内呈现良好的线性，r符合要求，对甲苯磺酰氯定量下限（LOQ）为0.18ng·mL-1(S/N=86），检测下限（LOD）为0.06ng·mL-1(S/N=34）。

2.4.3重复性

精密称取对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯50mg，于25mL量瓶中，平行制备6份，分别精密加入“2.3.2”项下对甲苯磺酰氯对照品储备液1.0mL，加入衍生化试剂12mL，室温下超声（53kHz,350W)30s溶解，室温下衍生10min，纯水稀释至刻度，摇匀，制成含有180ng·mL-1对甲苯磺酰氯的加标供试品溶液，进样分析。结果6份加标供试品（D170601）溶液中的对甲苯磺酰氯含量结果RSD为0.58%，表明该方法重复性良好。

2.4.4回收率

供试品中对甲苯磺酰氯含量低于定量下限，所以通过向供试品中加入不同含量水平的对照品溶液考察回收率，以评价方法的准确度。精密称取对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯50mg共9份，分别置于25mL量瓶中，精密加入“2.4.2”项下低（1.35μg·mL-1）、中（4.5μg·mL-1）、高（9.0μg·mL-1）浓度对照品储备液1.0mL，配制成含有对甲苯磺酰氯54.0、180.0、360.0ng·mL-1的加标供试品溶液各3份。分别加入衍生化试剂12mL，室温下衍生10min后纯水稀释至刻度，摇匀并进样分析。结果平均回收率（n=9）为96.3%，表明对甲苯磺酰氯衍生物回收率和准确度良好。见表1。

表1对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯回收率（n=3)

2.4.5溶液稳定性

精密称取对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯50mg，加入对甲苯磺酰氯对照品储备液1.0mL，加入衍生化试剂12mL，衍生后纯水定容，分别在0、1、2、3h记录对照品溶液和加标供试品中对甲苯磺酰氯的含量。将各时间点样品测得的峰面积与0h的结果相比较，相对峰面积变化在101.4%～103.2%之间，证明衍生溶液在3h内稳定性良好。见表2。

表2对照品和加标供试品溶液稳定性

2.5样品测定

取对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯供试品3批（批号：D170601,D170601R,D171001），每批精密称取50mg于25mL量瓶中，加入衍生化试剂12mL，衍生后纯水定容，进样分析，结果3批样品中对甲苯磺酰氯的含量分别为0.09、0.55、1.19ng·mg-1。

3、讨论

3.1衍生化试剂的选择

2,4-二硝基苯肼常作为羰基衍生化试剂[15]，因此，首先选用2,4-二硝基苯肼对对甲苯磺酰氯进行衍生。实验过程中发现，低浓度2,4-二硝基苯肼衍生反应不完全，衍生物稳定性差；高浓度2,4-二硝基苯肼在质谱中会加大背景噪音抬高基线，干扰测定的灵敏度及准确性。

胺类物质能够和苯磺酰氯生成磺酰胺，生成物较为稳定[14]，因此考虑使用苯胺作为衍生化试剂进行衍生化处理。实验发现，苯胺能够与对甲苯磺酰氯反应生成对甲苯磺酰胺，对甲苯磺酰胺在该色谱条件下稳定，同时不会和可能干扰物对甲苯磺酸以及样品对甲苯磺酸噻吩酯类反应，因此，选择苯胺作为衍生化试剂。

3.2衍生化试剂浓度的选择

在样品前处理时为了考察衍生化试剂浓度对反应的影响，分别配制了不同浓度（0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%,v/v）的衍生化试剂加入到平行对照品中。结果发现，当衍生化试剂浓度为0.3%(v/v）时，对甲苯磺酰氯的质谱信号响应最高、信噪比最大，因此，选择0.3%的衍生化试剂进行样品前处理。

3.3衍生化反应时间的选择

通过实验对比，加入同等浓度衍生化试剂之后，在室温下反应不同时间，不同衍生时间的衍生物峰面积RSD小于0.01%，说明衍生反应时间的变化对衍生程度的影响较小。

3.4结论

本实验建立了高效液相色谱-质谱联用方法测定对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯的含量，并进行了方法学验证，结果用于测试的3个批次的对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯的含量均低于对照品含量，因此本方法可以有效控制对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中的潜在基因毒性杂质对甲苯磺酰氯。该方法专属性强，灵敏度高，满足测定要求并可以作为质控方法应用于对甲苯磺酸-2-噻吩乙酯中对甲苯磺酰氯的测定。

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