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门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液中5-HMF和有关物质使用HPLC法测定结果

2020-07-20 416 上传者：管理员

摘要：目的:本文采用HPLC法测定门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛(5-HMF)和有关物质。方法:使用Welch Ultimate XB-C18(4. 6 mm×250 mm,5μm)色谱柱，以0. 67%磷酸二氢钾溶液-甲醇(76∶24)(用磷酸调节pH值至2. 7)为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，在波长287 nm检测。结果:5-HMF和杂质均得到良好分离，方法专属性较好。5-HMF浓度在0. 48～19. 20μg•m L-1范围内有线性关系良好(r2=0. 999 5)，洛美沙星浓度在1. 97～394μg•m L-1范围内有线性关系良好(r2=0. 999 5)。结论:建立的5-HMF和有关物质检测方法可用于门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液的质量控制。

关键词：
5-羟甲基糠醛
HPLC
药剂师
药物分析
门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液
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门冬氨酸洛美沙星主要用于治疗敏感细菌引起的呼吸道、泌尿生殖器、肠道等组织感染以及中耳炎和鼻窦炎等疾病的治疗[1,2,3]。相应的制剂有门冬氨酸洛美沙星注射液(洛美沙星小针剂)和门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液(洛美沙星大输液)，大输液的执行标准有A公司的国家药品监督管理局标准YBH30102005和B公司的国家药品监督管理局标准YBH15122004[4,5]。洛美沙星大输液采用115℃高温灭菌30 min，灭菌中葡萄糖会产生5-羟甲基糠醛(5-HMF),5-HMF量超过一定浓度对人体横纹肌及内脏有损害，还具有神经毒性，所以在葡萄糖制剂中作为一种重要杂质需对其进行控制(标准规定不得过葡萄糖量的0.03%)，药品制剂中5-HMF的测定方法主要以HPLC法为主[6,7,8,9,10,11]。洛美沙星为喹诺酮类抗生素，门冬氨酸洛美沙星原料生产阶段会带入一定杂质，制剂生产和储存阶段由于氧化、光等因素也会产生降解，特别是光降解杂质具有一定毒害性，非常有必要控制上述杂质(有关物质)[12,13,14,15]。

法定标准均采用等度洗脱方法测定有关物质和5-HMF，保留时间记录至主峰3倍保留时间，流动相采用乙腈-磷酸盐缓冲液-0.05 mol·L-1四丁基溴化铵溶液(15∶85∶4)。按法定标准检验时发现杂质峰之间分离度较差，5-HMF、洛美沙星主峰与相邻杂质峰分离不完全(分离度小于1.5)，有干扰，见图1。洛美沙星主峰峰型较差有拖尾，且流动相中有离子对试剂四丁基溴化铵，长时间使用对色谱柱损害较大。为解决上述问题，特进行本研究。

图1法定标准的有关物质色谱图

1、仪器与试剂

岛津LC-20AT高效液相色谱仪(带PDA检测器)，METTLER MS205DU电子天平门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液(规格:100 m L∶门冬氨酸洛美沙星0.2 g与葡萄糖5.0 g，生产企业:A和B公司)，盐酸洛美沙星对照品(来源:中国药品生物制品检定所，批号:130452-200902，含量:90.3%),5-HMF对照品(来源:中国食品药品检定研究院，批号:111626-201610，含量:99.2%)，门冬氨酸洛美沙星原料(来源:哈尔滨三联制药，批号:20151201)，甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1色谱条件

采用Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱，流动相A:以0.67%磷酸二氢钾溶液-甲醇(76∶24)(用磷酸调节pH值至2.7)，流动相B:乙腈，梯度洗脱，流速:1 m L·min-1，柱温40℃，进样量10μL，检测波长287 nm。梯度洗脱程序见表1。

2.2溶液配制

精密称取洛美沙星对照品21.84 mg，加流动相A溶解并稀释至50 m L，摇匀，制成含洛美沙星浓度约为0.4 mg·m L-1的对照品溶液。精密称取5-HMF对照品7.74 mg，加水溶解并稀释至200 m L，摇匀，制成含5-HMF约为38μg·m L-1的对照品溶液。取门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液为供试品溶液，精密量取供试品溶液1mL，加流动相A稀释至500 m L，摇匀作为对照溶液。

表1流动相梯度洗脱表

取葡萄糖5 g加水溶解并稀释至100 mL作为空白辅料溶液。光照破坏溶液:取供试品溶液(B厂，批号:161103)在光照强度4 000 lx，放置1 d。紫外破坏溶液:取供试品溶液(B厂，批号:161103)在紫外灯下照射2 h。高温破坏溶液:取门冬氨酸洛美沙星原料约27 mg，加水10 mL溶解，沸水浴加热4 h。酸破坏溶液:取门冬氨酸洛美沙星原料约27 mg，加水1 mL溶解，再加10 mol·L-1盐酸溶液1 mL，沸水浴2 h候后再用10 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL中和，再加流动相A稀释至10 mL。碱破坏溶液:取门冬氨酸洛美沙星原料约27 mg，加水1 mL溶解，加入10 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，沸水浴2 h后再用10 mol·L-1盐酸溶液1 mL中和，再加流动相A稀释至10 mL。氧化破坏溶液:取门冬氨酸洛美沙星原料约27 mg，加水1 mL溶解，再加入30%过氧化氢溶液1 mL，沸水浴2 h后再加流动相A稀释至10 mL。

2.3检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对洛美沙星对照品溶液和5-HMF溶液在波长200～400 nm范围进行扫描，发现洛美沙星在210 nm和287 nm有最大吸收，5-HMF在284nm有最大吸收，见图2。210 nm为末端吸收干扰大，而287 nm基线噪音小、杂质吸收也大，还能兼顾5-HMF的测定，所以试验选择287 nm作为测定波长。

2.4溶剂的选择

采用水和流动相制备对对照溶液或5-HMF对照品溶液时，色谱图在2 min左右有溶剂峰干扰，所以试验选择采用流动相A作为溶剂以消除溶剂峰干扰。

2.5专属性考察

取空白辅料、流动相A以及酸、碱、氧化、光照和紫外破坏溶液，分别按“2.1”中色谱条件测定，见图3。结果表明流动相A不产生干扰，空白辅料出5-HMF峰外也无其他峰，也不产生干扰。破坏性试验显示洛美沙星在紫外和氧化条件下不稳定，在高温、碱、酸条件下较稳定，破坏试验均不同程度降解产生了杂质，但在上述色谱条件下有较好分离，对5-HMF及供试品中有关物质测定无干扰，说明建立的方法具有良好的专属性。由图3可知在光照下产生的杂质较多，说明洛美沙星对光敏感，故在生产、储存、运输的过程中尽量采取避光措施。

图2洛美沙星和5-HMF紫外吸收光谱和色谱图

2.6系统适用性试验

取氧化破坏溶液，按仪器工作条件进行测定，洛美沙星保留时间约为22 min，理论板数为6352，洛美沙星与相邻杂质峰分离度分别为4.1和2.3。

2.7方法学考察

2.7.1线性关系

取洛美沙星对照品适量，分别加流动相A制成浓度约为393、197、99、39、20、10、2μg·L-1的洛美沙星对照品系列溶液。取5-HMF对照品溶液适量，分别加流动相A制成浓度约为19、9.5、3.8、1.9、0.95和0.48μg·L-1的5-HMF溶液。取上述溶液，按仪器工作条件进行测定，记录色谱图，以相应物质的峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。结果表明，5-HMF浓度在0.48～19.20μg·m L-1范围内线性关系良好(y=67 217x-10 136,r2=0.999 5)，洛美沙星浓度在1.97～394μg·m L-1范围内线性关系良好(y=57 914x+69 480,r2=0.999 9)。

图3专属性试验图谱

2.7.2精密度和重复性

取浓度约为1.9μg·m L-1的5-HMF对照品溶液和浓度约40μg·m L-1的洛美沙星对照品，分别按仪器工作条件连续进样5针进行测定，结果5-HMF和洛美沙星峰面积RSD分别为0.6%和0.1%，表明本方法精密度良好。取供试品溶液(B公司，批号:161103)6份照上述色谱图条件测定，5-HMF峰面积RSD为0.2%，总杂质(除5-HMF外)峰面积RSD小于2%，表明该方法重复性好。

2.7.3定量限与检出限

取浓度约为0.95μg·m L-1的5-HMF对照品溶液和浓度约2μg·m L-1的洛美沙星对照品倍比稀释，按仪器工作条件进行测定，以信噪比满足3∶1和10∶1计算检出限和定量限。结果本方法5-HMF检出限和定量限分别为0.4 ng和1.1 ng，洛美沙星的检出限和定量限分别为0.4 ng和1.3 ng。

2.7.4回收率试验

取供试品(B公司，批号:161101)6份，每份5 m L，置10 m L量瓶中，分别加入浓度约为2.3μg·m L-1的5-HMF溶液5 m L，摇匀，按仪器工作条件进行测定，记录色谱图并计算5-HMF回收率。回收率为100.0%～103.9%，平均回收率为101.9%，回收率RSD为1.3%，说明本方法准确度良好。

2.8样品测定

取6批供试品溶液、对照溶液和5-HMF对照品溶液，按仪器工作条件进行测定，以外标法计算供试品中5-HMF的含量，以自身对照法计算样品中其他杂质的量，结果见表2。由表2可知，供试品中5-HMF未超过标准规定的0.03%，由于采用梯度洗过检出了更多杂质，总杂质量比法定方法测定结果大约0.1%。

表2样品含量测定结果

3、讨论

采用旋光法和滴定法测定门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液中葡萄糖含量时，门冬氨酸洛美沙星对检测均存在干扰，会导致结果出现偏差。本研究建立的采用HPLC-RID法测定门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液中葡萄糖含量方法前处理操作简单方便，能消除门冬氨酸洛美沙星产生的干扰，具有极佳的专属性。通过对本方法线性、精密度、回收率等方法验证，证明其具有高度的专属性、良好的准确度和重复性等特点，适用于门冬氨酸洛美沙星葡萄糖注射液中葡萄糖的含量测定。

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