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阿莫西林胶囊中高效液相色谱法测定有关物质技术

2020-07-20 1042 上传者：管理员

摘要：目的建立阿莫西林胶囊中有关物质的测定方法。方法采用Thermo hypersil C18色谱柱(4.6mm×100 mm,5μm),流动相A为2.72 g•L-1磷酸二氢钾溶液(pH=5.0),流动相B为甲醇,梯度洗脱;检测波长为210 nm,流速为1.5 mL•min-1,柱温为40℃。结果该方法下主峰与各杂质间分离良好,各成分在各自线性范围内与峰面积线性关系良好(r> 0.999);杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I的校正因子分别为1.76、1.40、0.78、1.05、1.76、0.68、0.86、1.17和1.14。定量限、检出限及回收率等均符合规定。用加校正因子的对照品法检测4批阿莫西林胶囊样品,测定结果与杂质对照品法一致。结论该法专属性强、灵敏度高、准确度和重复性好,可用于检测阿莫西林胶囊中有关物质。

关键词：
有关物质
校正因子
药品质量检验
阿莫西林胶囊
高效液相色谱
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阿莫西林为β-内酰胺类抗菌药物，临床上广泛应用于革兰阴性菌、革兰阳性菌等所致的感染性疾病、呼吸系统疾病及泌尿系统疾病[1,2,3]。该产品中的杂质种类比较多，为了减少医疗中的不良反应[4]，必须对其杂质进行控制。阿莫西林原料[5,6]、阿莫西林注射剂[7]、阿莫西林颗粒[8]中的杂质研究已有文献报道。本文改进了USP41版阿莫西林原料有关物质[9]方法，使阿莫西林胶囊中10种杂质与主成分可良好分离。通过方法学研究，验证了该检测方法的可行性，并对各杂质的相对校正因子进行了计算。通过强制降解试验和稳定性试验，分析了该产品中的杂质变化情况，对其杂质谱分析和质量控制有重要意义。

1、材料

1.1仪器

赛默飞Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国热电公司）；梅特勒-托利多AB265-S电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）。

1.2试药

阿莫西林（批号：130409-201512，含量：86.9%，中国食品药品检定研究院）；杂质D（纯度：73.0%）及杂质J（纯度：8.0%）为USP药典标准品，杂质C、H及杂质I（纯度均>90.0%，加拿大MC公司），杂质G（德国LGC公司，纯度：74.3%），杂质A、B、E、F对照品（加拿大TLC公司，纯度均>90.0%）。各化合物化学结构信息见图1。阿莫西林胶囊（英国葛兰素克，批号：2383，规格为0.25 g）；某公司提供的阿莫西林胶囊（批号：171101、171102、171103，规格为0.25 g）；硬脂酸镁（安徽山河药用辅料股份有限公司，批号：170829）；甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯，水为超纯水。

图1阿莫西林及其杂质成分的化学结构式

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Thermo hypersil C18（美国Thermo,4.6mm×100 mm,5μm）；流动相A:2.72 g·L-1磷酸二氢钾溶液（pH=5.0），流动相B：乙腈；检测波长：210 nm；流速：1.5 mL·min-1；柱温：40℃；进样量：10μL。梯度洗脱：0～10 min,97%A;10～30 min,97%～80%A;30～34 min,80%～97%A;34～44min,97%A。

2.2溶液的制备

2.2.1空白辅料溶液

按处方用量，精密称取硬脂酸镁适量于量瓶，以空白溶剂（流动相A，下同）定容，滤过，取续滤液。

2.2.2杂质对照品混合溶液

精密称取阿莫西林及各杂质对照品适量，置同一量瓶中，加空白溶剂稀释制成阿莫西林和各杂质对照品均为12.5μg·mL-1的混合溶液，作为系统适用性溶液。

2.2.3供试品溶液

取本品内容物适量，精密称定，用空白溶剂稀释至刻度，制成每1 mL中约含阿莫西林（按C16H19N3O5S计）1.25 mg的溶液，滤过，取续滤液。

2.2.4对照品溶液

精密称取阿莫西林对照品适量于量瓶，用空白溶剂稀释制成12.5μg·mL-1的溶液。

2.3分析条件的优化

取“2.2”项下杂质对照品混合溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，对“USP 41”阿莫西林原料药有关物质方法（梯度洗脱，0～10 min,97%A;10～22min,97%～75%A;22～26 min,75%～97%A）进行优化，选择能使有关物质达到更好分离的程序，结果显示优化后杂质F与杂质C分离度由0.79变为1.57，分离度得到良好的改善。

2.4系统适用性

分别精密量取空白溶剂、空白辅料溶液、杂质对照品混合溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图见图2。结果表明空白溶剂及辅料溶液均无干扰；各杂质色谱峰和主成分阿莫西林可实现基线分离，分离度>1.5，阿莫西林保留时间为2.307 min。

图2系统适用性试验结果

2.5专属性

取样品（批号：171101），分别配制成经强酸（0.5mol·L-1的盐酸溶液2 mL）、强碱（0.05 mol·L-1的氢氧化钠溶液2 mL）、强制氧化（3%过氧化氢溶液1 mL）、光照[（4500±500)Lx]强光下放置48 h、高温（80℃水浴加热60 min）破坏的溶液，注入液相色谱仪进行分析，结果见图3。该试验表明本品在酸、碱、氧化、光照、高温条件下均不稳定，杂质D1、D2在各破坏条件下均增大；在热破坏条件下杂质D1、D2、E1、F、C、E2增大。各检测溶液中主峰与前、后邻杂质峰分离度大于1.5。在各降解条件下，各检测溶液中主峰峰纯度匹配指数均大于980，符合要求。物料回收率均在90%～110%，物料守恒。

图3破坏试验高效液相色谱图

2.6精密度

取“2.2.2”项下杂质对照品混合溶液，精密量取10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录各杂质的保留时间和峰面积，并计算RSD。各杂质峰面积的RSD均<5.0%，保留时间的RSD均<1.0%，表明该方法精密度良好。

2.7定量限与检测限

逐步稀释“2.2.2”项下杂质对照品混合溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算信噪比。信噪比（S/N）为10的样品浓度即为定量限浓度，S/N为3的溶液浓度即为检测限，结果见表1。

2.8线性关系考察与校正因子计算

以25μg·m L-1的杂质对照品混合溶液为储备液，分别精密量取该储备液0.25、0.5、1.0、2.5、4.0、5.0m L于10 mL量瓶，稀释至刻度作为线性溶液1～6，该储备液为线性溶液7，分别取各线性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，各成分峰面积与浓度在一定范围内呈线性关系，按照斜率法计算各杂质相对校正因子f(f=K2/K1)[10,11];K1为各杂质回归方程中的斜率，K2为阿莫西林斜率，结果见表1。

表1线性方程、范围及定量限(LOQ)与检测限(LOD)结果

2.9溶液稳定性

分别取“2.2”项下杂质对照品混合溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，评价其在室温及低温环境下的稳定性。结果表明：(1)室温条件下，与0 min相比，供试品溶液在室温环境中放置2 h时，杂质D峰面积的相对平均偏差（RD）为35.6%，杂质C峰面积的RD为51.4%，均>20%，已不稳定；低温6 h内，供试品溶液中各杂质及单杂、总杂峰面积的RD均<20%；因此有关物质检测时供试品溶液应临用前新鲜配制或低温放置4℃，6 h内。(2)杂质对照品混合溶液，室温放置4 h时，杂质D、E峰面积（杂质D1、D2互为异构体，E1、E2互为异构体，可互相转化，因此峰面积按异构体加和计算）的RD分别为2.8%、5.3%，均>2%，不稳定；低温12 h内，阿莫西林及各杂质峰面积的RD均<2%，稳定。

2.1 0重复性与中间精密度

两位分析员、不同日期、两台不同仪器的情况下，按“2.1”项下色谱条件重复进样，测定杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质J、其他单杂含量的RSD分别为8.7%、7.6%、5.1%、6.6%、5.6%、5.1%；总杂含量的RSD为4.9%(n=12）；说明该方法检测阿莫西林有关物质重复性与精密度好。

2.1 1回收试验

称取样品9份（批号：171101），每份约12.5 mg，置10 mL量瓶中，分别加入4、5、6 mL 25μg·m L-1的杂质混合储备液，再分别以空白溶剂定容，分别作为80%、100%、120%的加标回收率溶液，每份回收率溶液平行配制3份。分别取供试品溶液、12.5μg·m L-1的杂质对照品混合溶液、加标回收率溶液，注入液相色谱仪，以杂质对照品外标法计算，结果各浓度下各杂质的回收率均在90%～108%,RSD均小于10%，说明此方法检测阿莫西林有关物质准确度高。

2.1 2耐用性试验

分别改变波长（±5 nm）、柱温（±2℃）、流速（±0.2 mL·min-1）、流动相p H(4.9、5.2）、色谱柱批号等色谱条件，与原色谱条件相比，系统适用性溶液中主峰与前、后邻杂质分离度均>1.5，各杂质含量检测结果的RD均在±20%以内，总杂含量检测结果的RD均在±10%以内，说明色谱条件略有变化时，对系统适用性及杂质的检测没有影响，该方法耐用性好。

2.1 3样品检测

取3批某公司生产的阿莫西林胶囊（0 d产品）及葛兰素史克生产的阿莫西林胶囊，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别用校正因子法与杂质对照品外标法计算，这两种方法各杂质含量的差值均在±0.03%以内，校正因子法结果可靠，可用于阿莫西林胶囊中有关物质的测定，结果见表2。

表2阿莫西林胶囊中有关物质的检测结果(%，校正因子法)

2.1 4加速试验

对本品进行加速试验[考察条件：（40±2）℃/RH(75±5）%）]，发现加速6个月时，171101～171103批样品，杂质E1、E2含量均增加至约0.5%,2383批杂质E1、E2含量分别为1.58%和1.65%；与0 d检测结果相比，其他杂质未明显增加。

3、结论

通过优化USP41版阿莫西林原料药有关物质方法，建立了测定阿莫西林胶囊中特定杂质的分析方法。方法学研究表明，该法专属性强、灵敏度高、耐用性强、重复性与精密度好，采用加校正因子的阿莫西林对照品法可准确测定阿莫西林胶囊中的各特定杂质含量。该产品中杂质A为阿莫西林原料药合成过程中引入的起始物料残留[12]；专属性试验及稳定性试验表明强制降解试验中增加最明显的杂质为杂质D，而杂质E含量在加速试验中增加最快；杂质J在0 d产品中含量已为0.26%～0.38%，但后续稳定性数据中未增长；杂质B、杂质F、杂质G、杂质H均未检出，且稳定性试验中仍未检出；杂质I为对羟基苯甘氨酸，该杂质在化学合成的原料中的含量明显高于酶法[12,13]，其含量在专属性试验和稳定性试验中均未显著增加。因此杂质A及杂质I应参考原料药合成工艺，在原料中控制，而杂质D、杂质E、杂质J需重点关注并订入胶囊质量标准。

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