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甲硝唑片在中国健康受试者中的生物等效性研究

2024-07-09 46 上传者：管理员

摘要：目的评价甲硝唑片受试和参比试剂在中国健康受试者中的生物等效性。方法采用单剂量、两周期、随机、开放、自身交叉、空腹和餐后两种状态下的试验设计。空腹和餐后试验分别入组24例受试者，每周期分别单次口服甲硝唑片受试和参比制剂200 mg。用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定血样中甲硝唑的药物浓度，应用非房室模型计算药代动力学参数并用SAS 9.3软件进行生物等效性分析。结果空腹试验口服甲硝唑片受试制剂和参比制剂的主要药动学参数：Cmax分别为(4 855.00±1 383.97)和(4 799.13±1 195.32)ng·mL-1,AUC0-t分别为(54 834.68±12 697.88)和(55 931.35±11 935.28)ng·h·mL-1,AUC0-∞分别为(56 778.09±13 937.76)和(57 922.83±13 260.54)ng·h·mL-1,Tmax分别为1.17和1.00 h,t1/2别为(8.99±1.76)和(9.11±1.73)h。Cmax、AUC0-t和AUC0-∞几何平均值(90%置信区间，CI)均在等效区间80.00%～125.00%。餐后试验口服甲硝唑片受试制剂和参比制剂主要药代动力学参数：Cmax分别为(4 057.08±655.08)和(4 044.17±773.98)ng·mL-1,AUC0-t分别为(55 956.42±12 228.12)和(55 121.04±11 784.55)ng·h·mL-1,AUC0-∞分别为(58 212.83±13 820.00)和(57 350.38±13 229.46)ng·h·mL-1,Tmax分别为2.50和2.25 h,t1/2别为(9.37±1.68)和(9.37±1.79)h。Cmax、AUC0-t和AUC0-∞几何均值(90%置信区间CI)均在等效区间80.00%～125.00%。结论甲硝唑片受试制剂和参比制剂对于中国健康成年受试者在空腹和餐后条件下均具有生物等效性。

关键词：
抗厌氧菌
液相色谱-串联质谱法
生物等效性
甲硝唑
药代动力学
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甲硝唑是硝基咪唑类衍生物，具有抗厌氧菌、抗阿米巴和抗滴虫作用，临床上多用于预防和治疗各种厌氧菌感染，尤其适用于治疗腹腔、生殖器、下呼吸道、消化道、皮肤及软组织、关节及口腔疾病中的厌氧菌感染，由于其疗效确定，且生物毒性较小，一直被国内外公认为预防和治疗厌氧菌感染的基本药物和首选药物[1,2,3]。本文旨在研究甲硝唑片的药代动力学特征及安全性，参考《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》等文件[4,5],开展人体生物等效性临床试验。对比国产制剂与原研药物之间的药代动力学特征和生物等效性，以期为临床用药提供数据依据，为临床医生提供更多的选择和参考。

一、材料、对象与方法

1 材料

药品受试制剂(test, T):甲硝唑片，规格：每片200 mg, 批号：JX19012201,石家庄四药有限公司生产；参比制剂(reference, R):甲硝唑片，规格：每片200 mg, 批号：124080B,英国Winthrop Pharmaceuticals UK Limited (Zentiva)持证，西班牙Famar Health Care Services Madrid S.A.U.生产；甲硝唑化学对照品，含量：100.0%,批号：100191-201808,中国食品药品检定研究院提供；甲硝唑-d4(内标),化学纯度：99.5%,同位素纯度：99.0%,含量：98.7%,批号：2197-015A4,购自加拿大TLC公司。

仪器LC-20ADXR液相色谱泵、LCMS-8045质谱仪、CTO-20A柱温箱、SIL-30ACMP自动进样器，均为日本SHIMADZU公司产品；Centrifuge 5810R冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品。

2 受试者选择

本试验由河北省人民医院药学部Ⅰ期临床试验研究室完成，试验方案获得河北省人民医院伦理委员会批准，批件号(2019)药伦审第(05)号。临床试验平台备案号：CTR20190677。所有受试者均自愿签署知情同意书。

入选标准①年龄≥18周岁；②男性体质量≥50 kg, 女性体质量≥45 kg, 体质量指数在19.0～26.0 kg·m-2(含临界值);③体格检查、生命体征、实验室检查、心电图和胸部X线片等检查结果正常或异常无临床意义等。

排除标准①对甲硝唑或其他硝基咪唑类有过敏史者；②筛选前14 d内服用过任何药物包括维生素和保健品，或有药物依赖史、药物滥用史者；③筛选前28 d内失血或献血超过200 mL者；④妊娠或哺乳期妇女及签署知情同意书开始3个月内有妊娠计划者等。

3 给药方案与血样采集

本研究按照单中心、单剂量、随机、开放、两周期、自身交叉对照试验设计，入组受试者按筛选号顺序随机分配至T-R或R-T组。禁食至少10 h, 于试验第1天和第8天空腹和餐后状态下给药，按照随机要求口服受试制剂或参比制剂200 mg, 用水240 mL送服。服药前后1 h禁止饮水。2周期清洗期为7 d。

空腹试验的采血时间点为服药前1 h内(0 h)和服药后0.25、0.667、1、1.333、1.667、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h; 餐后试验的采血时间点为服药前1 h内(0 h)和服药后0.25、0.667、1、1.333、1.667、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h。每次采集静脉血约4 mL置于EDTA-K2抗凝管中，在采血后1 h内，2～8 ℃下，以3 700 r·min-1离心10 min, 分离血浆，分成2份分别置于检测管和备份管中，在2 h内转移到-60 ℃冰箱保存待测。血浆样品采集和处理全程须冰浴且避光(在波长500 nm以上的黄光灯下操作)。

4 测定方法与血样处理

色谱条件色谱柱：GL Sciences Inc. InertSustain, C18 HP(3.0 μm, 2.1 mm×50.0 mm);流动相A:5 mmol·L-1乙酸铵水溶液，流动相B:100%甲醇溶液；流速：0.40 mL·min-1;柱温：40 ℃;进样器温度：4 ℃。梯度洗脱程序：0～0.50 min, 10%B;0.51～1.50 min, 10.0%B→95.0%B;1.51～2.50 min, 95.0%B;2.51～2.60 min, 95.0%B→10.0%B;2.61～3.00 min, 10.0%B;分析时间：3.00 min; 进样量：3.0 μL。

质谱条件正离子分析模式；电离化模式；雾化气流量：3.00 L·min-1;干燥气流量：10.00 L·min-1;甲硝唑和甲硝唑-d4的离子对分别为m/z 172.10→128.05和m/z 176.15→128.10,碰撞能量分别为-16和-16 V,Q1偏转电压分别为-12和-13 V,Q3偏转电压分别为-25和-15 V,停留时间分别为100和100 ms。

血浆样品处理样品室温黄光条件下融化后，涡旋混匀；吸取样品50.00 μL至96孔板中，加入600 ng·mL-1内标溶液50.00 μL;对于双空白样品加入50%ACN 50.00 μL,摇匀；加入100%ACN 200.00 μL,摇匀，在设置温度为4 ℃条件下以3 700 r·min-1离心10 min; 转移上清溶液50.00 μL至加有超纯水200.00 μL的96孔板中，摇匀待测。

5 方法学考察与评价

专属性取6个不同批次空白血浆，按“血浆样品处理”步骤分别对甲硝唑和内标进行测定，结果表明甲硝唑与其内标的保留时间分别为1.50和1.49 min。干扰峰不影响测定的准确度，该方法专属性良好，见图1。

标准曲线和定量下限取质控浓度分别为40.00、80.00、240.00、480.00、1 200.00、4 800.00、9 600.00和12 000.00 ng·mL-1的甲硝唑标准曲线样品，按“血浆样品处理”项操作。以甲硝唑峰面积与内标甲硝唑-d4峰面积比值(y)对甲硝唑血浆浓度(x)作加权回归计算，用最小二乘法(权重系数为1/C2)进行线性拟合，求得甲硝唑回归曲线方程y=1.65x+2.92×10-3(r=0.999 9),结果表明甲硝唑血药浓度在40.00～12 000.00 ng·mL-1线性关系良好，最低定量下限为40.00 ng·mL-1。

精密度和回收率用人空白血浆将甲硝唑标准品溶液稀释成质量浓度分别为40.00、120.00、600.00、6 000.00、9 000.00 ng·mL-1的质控样品，按“血浆样品处理”项操作，每种质量浓度取6个样本，连续测定3 d, 以当日测得的浓度计算日内、日间精密度(relative standard deviation, RSD),另取低、中、高(120.00、6 000.00和9 000.00 ng·mL-1)3个质量浓度的质控样品按“血浆样品处理”项操作，记录待测物与内标的色谱峰面积。根据血浆样品处理后待测物峰面积和血浆提取样品再加入待测物后测得的峰面积比，计算绝对回收率，见表1。

图1 甲硝唑和甲硝唑- d4典型色谱图

表1 甲硝唑在人血浆中的准确性、精密度及回收率

基质效应取9个不同来源的空白血浆，分别考察低、中、高3个质控浓度(120.00、6 000.00、9 000.00 ng·mL-1)的甲硝唑在血浆基质存在时色谱峰面积和在基质不存在色谱峰面积的比值。内标归一化基质效应是用分析物的基质效应除以内标的基质效应。结果显示甲硝唑在低、中、高质量浓度的内标归一化基质因子均值分别为1.02±0.02、1.00±0.01、1.00±0.01,变异系数(coefficient of variation, CV)分别为1.96%、1.00%、1.00%,均<15.00%。

稳定性全血样本在冰浴环境避光放置2 h稳定；血浆样本在室温黄光放置22 h和-20 ℃冷冻冰箱存放20 d、在-60 ℃和-20 ℃冷冻冰箱反复冻融循环5次稳定；处理后的血浆样品进样溶液在自动进样器4 ℃条件下放置89 h稳定；处理后样品再进样在自动进样器4 ℃条件下放置83 h稳定，平均相对偏差(relative error, RE)不超过±15.0%,%CV≤15.0%。

6 统计学处理

药代动力学分析、生物等效性评价、安全性统计分析，均采用SAS 9.3软件进行。非房室模型法分别计算受试者空腹和餐后口服受试制剂和参比制剂后甲硝唑的药代动力学参数。将主要药代动力学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞经对数转换后进行方差分析(ANOVA)和90%置信区间分析。如果Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的GMR的90%CI均不超出80.00%～125.00%,可以判断受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

二、结果

1 试验完成情况

空腹试验共筛选102例受试者，24例入组，其中22例完成试验，2例未完成试验。随机号K007受试者(R-T)于清洗期发生过敏反应(接受药物治疗),退出试验，第二周期未服药，故第二周期未纳入药代动力学浓度集(pharmacokinetic concentration set, PKCS)、药代动力学参数集(pharmacokinetic parameter set, PKPS)和生物等效性集(bioequivalence set, BES);随机号K013(R-T)受试者于第一周期给药当天采集了3个采血点样本后出现晕针反应，退出试验，2周期均未纳入PKCS、PKPS和BES。这2例均纳入安全分析集。餐后试验共筛选92例受试者，24例受试者入组，且全部完成试验，全部纳入PKCS、PKPS和BES。

2 血药浓度-时间曲线

空腹和餐后试验，受试者口服甲硝唑受试制剂和参比制剂后，平均血药浓度-时间曲线见图2,空腹试验和餐后试验2种制剂的平均血药浓度-时间曲线重合度均良好。

图2 受试者服用甲硝唑受试制剂(T)和参比制剂(R)后的平均血浆浓度-时间曲线

表2 受试者服用甲硝唑受试制剂和参比制剂后主要药代动力学参数

3 药代动力学参数

空腹组和餐后组受试者口服甲硝唑片受试制剂和参比制剂的主要药代动力学参数，见表2。

4 生物等效性评价

空腹试验受试制剂和参比制剂的Cmax、AUC0-t及AUC0-∞几何均值的比值分别为101.99%、98.77%、98.85%,90% CI分别为97.00%～107.22%、96.94%～100.63%、97.01%～100.72%,均在80.00%～125.00%,个体内变异分别为9.63%、3.58%和3.60%。餐后试验受试制剂和参比制剂的Cmax、AUC0-t及AUC0-∞的几何均值的比值分别为100.76%、101.51%和101.47%,90%CI分别为97.26%～104.39%、99.71%～103.35%、99.68%～103.30%,均在80.00%～125.00%,个体内变异分别为7.15%、3.61%和3.60%。表明甲硝唑受试制剂和参比制剂在空腹和餐后条件下均具有生物等效性。

5 安全性评价

本试验空腹和餐后共48例受试者均无非预期的药物不良反应和严重不良事件发生。空腹试验15例(62.50%)受试者发生32例次不良事件，1例次为2级，其余不良事件均为1级。1例4例次不良事件与试验用药关系为“可能有关”,记为药物不良反应，药物不良反应发生率为4.17%。餐后试验16例(66.67%)受试者发生37次不良事件，均为1级。2例3例次不良事件与试验用药关系为“可能有关”,记为药物不良反应，药物不良反应发生率为8.33%。

三、讨论

本研究采用的甲硝唑药代动力学检测方法为高效液相色谱质谱联用法，相比其他检测手段具有高灵敏度、高精确度、稳定和专属性强等优点，因此被广泛使用在单剂量药物生物等效性试验中[6,7]。此外，本研究在设计上采用单剂量、两周期、随机、开放、自身交叉的方法，避免了由于个体差异、使用方法等混杂因素对最终结果的影响，并通过统计方法进一步计算和比较了不同状态下的药代动力学参数，从而说明2种制剂的生物等效性。通过本试验的结果表明，甲硝唑片受试制剂与参比制剂Cmax、AUC0-t及AUC0-∞的几何均值及其90%置信区间均在等效区间(80.00%～125.00%)范围内，说明2种药物在中国健康人体中空腹和餐后状态下具有生物等效性。2种药物单剂量自身交叉试验期间均未发生非预期的不良事件和严重不良事件，说明2种药物的安全性均良好。

参考文献:

[4]国家药品监督管理局药品审评中心.以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则[EB/OL].

[5]国家食品药品监督管理总局.总局关于发布普通口服固体制剂参比制剂选择和确定等3个技术指导原则的通告 (2016年第61号)[EB/OL].

文章来源:彭秀晴,郭彩会,刘亚丽,等.甲硝唑片在中国健康受试者中的生物等效性研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1943-1947.