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文章特点—

干细胞经鼻移植能有效绕过血脑屏障，可迅速进入中枢神经系统，可能是一种安全、非侵入性的干细胞移植路径；

该实验结果显示人脐带间充质干细胞和人神经干细胞均可迁移至大鼠脑内。

文题释义：

干细胞经鼻移植：动静脉移植、脑立体定位移植、腰椎穿刺以及侧脑室移植创伤大、操作难度大，无法应用于临床。经鼻给细胞的优势在于易于操作、无侵略性，鼻黏膜面积大且黏膜下血管非常丰富，细胞可穿过血脑屏障经嗅神经、三叉神经和脑脊液通路到达脑内。

干细胞移植治疗早产儿脑白质损伤：早产儿髓鞘损伤后很难再生，但细胞移植尤其是间充质干细胞和神经干细胞，对于治疗脑白质损伤具有一定的临床效果。人脐带间充质干细胞来源丰富、采集方便、无伦理争议、不易突变、致癌潜能低；人神经干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性低，移植后很少会引起排斥反应，细胞成活率高，具有广泛的应用前景。

据世界卫生组织统计，全世界每年约有1500万早产儿在受孕后37周内出生，每10个活产婴儿中就有1个早产儿，早产儿是5岁以下婴儿死亡的主要原因[1]。尽管目前早产儿护理方面的条件已经显著改善，但患有慢性神经功能障碍的早产儿数量仍持续增加[2]。在临床前研究中，脑低温疗法对脑白质损伤和少突胶质前体细胞变性提供了很好的保护[3,4]。将脑低温治疗和预防脑死亡的药物联合使用是治疗早产儿脑白质损伤的潜在方法。然而，目前关于早产儿低温治疗安全性的临床资料还不够充分[5]，许多药物尚未对早产儿脑白质损伤进行广泛评估。近年来干细胞治疗已成为一种修复神经功能缺损的治疗手段受到人们的关注。干细胞常用的移植路径如动静脉移植、脑立体定位移植、腰椎穿刺以及侧脑室移植对脑组织具有一定的创伤性、操作难度高，不适用于早产儿的临床应用。研究表明人脐带间充质干细胞和人神经干细胞可以分泌多种营养因子和生长因子，促进血管再生，加强突触联系，修复中枢神经组织再生[6,7,8,9]。一般来说，只有小的亲脂分子通过细胞外被动扩散才能通过正常的血脑屏障，这些多肽类神经营养因子尽管可以促进神经再生，但很难穿过血脑屏障到达脑组织[10]。因此将这些干细胞研究转化为临床应用，需要改善细胞递送策略以克服中枢神经系统血脑屏障。干细胞经鼻黏膜移植是非侵入性的，操作简单方便，不良反应小，可反复操作[11,12]，细胞可以快速到达脑组织内。

该实验拟探讨人脐带间充质干细胞和人神经干细胞经鼻移植后能否穿过血脑屏障迁移到达大鼠早产儿脑白质损伤模型损伤区域，为临床干细胞治疗早产儿脑白质损伤提供新的移植思路并提供一定的理论依据。

1、材料和方法

1.1设计

对比观察动物实验。

1.2时间及地点

2019年3至10月在中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室完成。

1.3材料

人脐带组织源于健康足月妊娠产妇，人胎脑组织源于10-13周龄的胚胎，由中国人民解放军总医院第六医学中心妇产科和儿科提供，术前均征得供者同意并签订知情同意书，且该实验已经通过中国人民解放军总医院第六医学中心伦理委员会批准(批准号：20170812)。

实验试剂：商品化无血清培养基购于北京东铭源科技有限公司，培养基中已添加细胞培养所需成分，可直接使用。CM-Dil(40718ES50，上海翊圣生物科技有限公司)；MBP大鼠单克隆抗体(ab7349,Abcam公司)；透明质酸酶(H3506,Sigma公司)；AlexaFluor488(ab150153,Abcam公司)；抗人核单克隆抗体(MAB1281,Millipore公司)；DMEM/F12培养基、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Gibco公司)。

实验动物及分组：清洁级SD孕鼠由北京维通利华提供，饲养于22-25℃、12h光照/12h黑暗的环境中，自由进食与饮水。所有动物实验均经过中国人民解放军总医院第六医学中心实验动物伦理委员会批准，对动物的处理均符合国际动物使用准则。根据实验的需要，将大鼠随机分为假手术组(n=10)、模型对照组(n=10)、人脐带间充质干细胞移植组(n=10)和人神经干细胞移植组(n=10)。

1.4实验方法

1.4.1人脐带间充质干细胞的分离培养

人脐带组织源于健康足月妊娠产妇，由中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室制备人脐带间充质干细胞，取剖宫产胎儿脐带，生理盐水清洗，剪除羊膜和血管，将剩余组织剪成3-5cm的组织段，剥离脐带内部华通氏胶；转移入青霉素小瓶中剪碎，剪碎后收集于T75培养瓶，加入商品化无血清培养基，放置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养48h，全量换液；待细胞融合至80%-90%时用胰酶消化传代，按1∶3比例传代，约7d传1代，共传3代。

1.4.2人脐带间充质干细胞的成脂鉴定

取生长状态良好的第3代人脐带间充质干细胞，接种于6孔板，待细胞融合至80%，加入成脂细胞诱导液2mL，每隔3d换液1次，镜下观察分化情况，待大量脂滴形成后进行染色。成脂诱导分化结束后，每孔加入2mL40g/L多聚甲醛固定10min,PBS洗2次，每孔加入0.3%油红O染料室温染色15min,PBS洗3次，倒置显微镜下观察拍照。

1.4.3人神经干细胞的分离培养和鉴定

人胎脑组织源于10-13周龄的胚胎，由中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室制备人神经干细胞。胎脑组织经机械分散、离心、分离等步骤后形成单细胞悬液，接种于神经干细胞专用培养基上，传代扩增到第3代，待神经球形成时，收集吹打使之分离，低速离心后浓缩于PBS中制成细胞悬液，每12μLPBS体系中细胞数为106。为更好地示踪和观测，移植前用CM-Dil染料标记人神经干细胞，先于37℃孵育5min，再于4℃孵育15min。标记完成后，PBS清洗细胞，用神经干细胞专用培养基重悬细胞。依据神经干细胞特异性标志物Nestin免疫荧光细胞化学染色鉴定人神经干细胞[13]。

1.4.4两种细胞体外Transwell迁移实验

应用6孔Transwell系统，上室每孔分别加入2×105第3代人脐带间充质干细胞或人神经干细胞悬液，下室分别加入各自专用的细胞培养基，于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养14h，取出Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗3遍，甲醇固定30min，将小室适当风干，DAPI染色10min，倒置显微镜下计数滤膜下侧两种干细胞迁移数量。

1.4.5早产儿脑白质损伤模型的建立

参照既往研究制备大鼠早产儿脑白质损伤模型[14,15,16]，出生后3d给予4%水合氯醛(6mL/kg)腹腔麻醉SD大鼠，麻醉后仰卧位固定幼鼠于手术台上，充分暴露颈部，乙醇消毒表面皮肤，锁骨略上方正中线处用手术刀切开0.5cm切口，显微镊分离胸骨舌骨肌，剥开鞘膜，分离迷走神经，逐层分离暴露右侧颈总动脉，用电凝笔将右颈总动脉离断，观察无出血、确认血管完全离断后，缝合皮肤，术后放入母鼠身旁，整个过程在5min内完成。待幼鼠完全苏醒约1h后，送入恒温缺氧箱(37℃，体积分数为6%O2)中缺氧90min，之后送回母鼠笼内。造模后7d进行MBP免疫荧光染色判断脑白质损伤程度，假手术组仅暴露右侧颈总动脉，未进行颈总动脉离断及缺氧。

1.4.6免疫抑制剂的使用

移植前3d开始腹腔注射环孢素，每日固定时间注射1次，剂量为10mg/kg，直至观察点，防止移植的异种细胞被排斥，具体步骤：注射针吸取环孢素液，食指和拇指捏住鼠头背部皮肤，使腹部向上，将注射针与腹部表面呈45°刺入腹腔，回抽无血，缓慢推注环孢素。假手术组和模型组不注射免疫抑制剂。

1.4.7细胞经鼻移植

造模后3d的幼鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台，用小纱布卷垫其颈部，使得头部稍高；微量注射器针头套入塑料软管，沿鼻中隔向鼻腔后上方内插入5-7mm，相当于嗅黏膜区域，移植细胞前30min滴入透明质酸酶6μL(100U)，每侧鼻腔每次滴入3μL，两侧鼻腔交替进行滴入，间隔时间为15min，避免窒息。两种细胞均用PBS重悬，细胞浓度均为1×106(12μL)，每侧鼻孔滴注5×105细胞，双侧鼻孔分别滴注1次。单侧滴注时间为5min，停留2min，缓慢拔出塑料软管，注射完保持仰卧位，以液体不流出为准。当一侧鼻孔给细胞时，将幼鼠的口及另一侧鼻孔稍微堵塞，借助幼鼠呼吸促进细胞进入到脑组织[17]；整个移植过程应密切关注幼鼠的呼吸状态，保持体温在37℃，避免麻醉低温造成的损害。假手术组和模型组经鼻给予同等量的透明质酸酶和PBS。

1.4.8免疫荧光染色

造模后7d，模型组随机选取3只大鼠，灌注取脑进行冰冻切片，厚度为8μm，每个鼠脑选取海马层面3张不连续的冰冻切片，观察扣带、胼胝体和外囊处MBP的表达。冰冻切片复温后，加入含0.3%TritonX-100的PBS洗3次，每次5min；体积分数为5%胎牛血清室温封闭1h；按1∶100稀释MBP一抗，4℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5min；加入驴抗大鼠AlexaFluor488免疫荧光二抗，室温避光孵育1h，用含DAPI的封固剂进行封固，在荧光显微镜下进行观察拍照。

1.4.9免疫组化染色

移植后24h，各组选取6只大鼠，灌注取脑进行冰冻切片，厚度为8μm，选取胼胝体、海马平面，冰冻切片PBS洗3次，每次5min，滴加新鲜配制的体积分数为3%H2O2室温孵育5-10min，灭活内源性酶；按1∶100稀释小鼠抗HuNu一抗，4℃孵育过夜；PBS洗3次，每次3min；滴加二抗MaxVisionTM3/HRP试剂，室温孵育30min;PBS洗3次，每次3min，加新鲜配制的UltraDAB显色试剂显色；PBS冲洗终止显色，苏木精复染，PBS返蓝，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.5主要观察指标

(1)两种细胞的形态学特征、体外迁移能力；(2)造模后7dMBP免疫荧光染色观察损伤侧髓鞘丢失情况；(3)移植后24h两种细胞在脑内的迁移情况。

1.6统计学分析

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，数据以表示，各组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性意义。采用GraphpadPrism6.0软件作图。

2、结果

2.1细胞的形态变化

未染料标记的人脐带间充质干细胞呈长梭形、纺缍形等多种形态分布生长，类似成纤维细胞，漩涡状生长，见图1A,B。CM-Dil染料标记的人神经干细胞荧光显微镜下呈红色荧光，标记率达95%以上，见图1C,D。2.2人脐带间充质干细胞的成脂鉴定结果加入成脂诱导液培养5d后可见少量细小的脂滴形成，随着诱导时间延长，脂滴逐渐变大变圆。诱导第20天时进行油红O染色，可见脂滴被染成红色，边界清晰，见图2。

2.3细胞体外迁移能力

细胞接种在上室，经过14h培养后两种细胞迁移率为16%，无差异，见图3。

2.4造模后MBP染色结果

造模后7d，免疫荧光染色观察模型组正常侧和损伤侧扣带、胼胝体和外囊处MBP表达，正常侧MBP的表达量明显高于损伤侧，表明脑白质损伤模型白质区域髓鞘丢失，见图4。统计学分析显示正常侧扣带、胼胝体和外囊区域MBP的表达面积明显高于损伤侧，差异有显著性意义(P<0.05)，见图5。

2.5细胞体内迁移结果

经鼻移植细胞后24h，抗人核抗体免疫组化染色显示人脐带间充质干细胞迁移至正常侧和损伤侧皮质、胼胝体和海马区域，见图6A-F;CM-Dil荧光标记显示人神经干细胞迁移至损伤侧皮质、胼胝体和海马区域，且人脐带间充质干细胞迁移量相对人神经干细胞较多，见图6。

3、讨论

脑白质损伤是早产儿最常见的脑损伤形式之一，一方面是由于早产儿脑血管发育尚未成熟，血管调节能力差，容易出现脑供血障碍。另一方面由于早产儿在胎龄23-32周期间，脑内少突胶质系细胞具有较强易感性，容易在缺氧、缺血、宫内感染等不利因素作用下发生凋亡和坏死[18]。脑白质损伤被认为是脑瘫的基础，50%的脑白质损伤患儿多留有严重的神经发育障碍，如认知或行为缺陷[19]。研究表明，早产儿发生脑瘫的概率明显大于足月儿，且随着早产儿胎龄的降低，留有后遗症的风险显著增加[20]。围产期脑损伤常导致典型的神经发育缺陷，如运动障碍、智力和发育迟缓、学习障碍以及日后生活中的精神障碍，但目前脑白质损伤缺乏有效的治疗措施[21]。

干细胞治疗逐渐成为医学界探索的新兴领域，目前细胞移植的方法主要有动脉移植、静脉移植、脑立体定位移植、腰椎穿刺以及侧脑室移植，这些方法具有一定的创伤性。动脉移植细胞可直接快速到达病灶，但易导致微血栓形成，操作复杂，危险性较高[22]；静脉移植细胞迁移时间长、迁移率低，细胞易迁移至肝、肺等其他脏器，可能导致肺栓塞[23]；脑立体定位移植对脑组织造成机械性损伤，移植后增加的液体容量挤压周围组织可能会产生容积占位效应，进一步造成脑损伤[24]；腰椎穿刺移植手术要求高，操作困难，易造成炎症反应[25]；侧脑室移植的干细胞可随脑脊液分布至整个大脑和脊髓，适用于广泛病变的治疗，但不适合小范围病变的治疗[26]，因此探寻一种无创、方便有效的移植路径是必要的。经鼻路径是非侵入性的，易于操作，临床创伤小；鼻黏膜面积大，动脉、静脉和毛细血管交织成网状，黏膜下血管非常丰富，药液可迅速吸收至血管进入体循环[27]，已有初步研究表明经鼻递送细胞能够进入幼鼠脑内[28,29,30,31]，因此经鼻黏膜移植干细胞或可成为修复大脑损伤的一种非侵入性治疗方法。

由于人脐带间充质干细胞具有来源丰富、采集方便、无伦理争议、不易突变、致癌潜能低等优点[32,33]，已被广泛应用于各种组织损伤领域。ZHAO等[34]研究表明经鼻给予人脐带间充质干细胞条件培养基2周后能促进大鼠脑缺血模型功能恢复和血管重建。LI等[35]利用胎羊制备早产儿脑白质损伤模型，该研究提示脐血间充质干细胞经鼻移植是通过维持少突胶质细胞的发育、抑制小胶质细胞激活、促进巨噬细胞迁移，以及外周和大脑的抗炎与免疫调节机制发挥神经保护作用的。神经干细胞具有自我更新增殖和多向分化潜能，免疫原性低，移植后很少会引起排斥反应，细胞成活率高[36,37]，研究发现经鼻移植神经干细胞是一种安全有效的方法，可替代外科注射或血管内给药[17]。它不仅通过旁分泌作用改变组织的微环境，还可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，替代损伤的细胞发挥生物功能[38]。目前关于人脐带间充质干细胞和人神经干细胞经鼻移植治疗早产儿脑白质损伤的研究报道尚且很少，因此该实验设计经鼻移植人脐带间充质干细胞和人神经干细胞治疗早产儿脑白质损伤大鼠模型，观察这两种细胞是否可以通过鼻黏膜迁移至病变区以及在体内的迁移情况。

该研究移植时间窗选择造模后3d，主要基于以下考虑：(1)缺血缺氧脑损伤后3-7d，损伤区域各种生化物质和细胞因子开始激活[39]。早产儿脑白质损伤急性期释放的多种化学物质具有趋化作用，有利于异位移植的干细胞向病灶周围迁移、归巢；(2)脑损伤后神经细胞发生凋亡，而凋亡的高峰时间在缺血3d后发生。该研究移植时间窗选择在造模后3d，即在细胞发生凋亡的高峰之前进行移植。啮齿类动物在出生后10d髓鞘开始逐渐发育成熟[40]，早产儿脑白质损伤主要是少突胶质前体细胞减少和分化障碍，脑白质髓鞘化障碍，MBP作为成熟少突胶质细胞的标志物之一，其含量变化代表着脑白质的损伤程度。因此，该研究在造模后7d通过MBP免疫荧光染色进行模型验证。造模后7d发现损伤侧MBP阳性面积表达减少，说明髓鞘丢失、白质损伤，早产儿脑白质损伤动物模型建立成功。

体外实验发现人神经干细胞和人脐带间充质干细胞迁移率一样；体内实验发现移植细胞后24h人神经干细胞迁移能力稍弱于人脐带间充质干细胞，但是也可发生迁移，证明鼻腔移植在干细胞治疗领域是一种通用型的移植方法，人脐带间充质干细胞和人神经干细胞经鼻移植路径都是可行的。干细胞进入到脑组织中主要的障碍在于血脑屏障和血脑脊液屏障。如何跨过屏障进入到脑组织发挥治疗作用成为目前基础研究急需解决的问题。目前初步认为经鼻移植的路径有横过筛状板后的嗅神经实质通路、穿越筛状板后的嗅神经脑脊液通路、通过三叉神经脊神经节的三叉神经脑脊液通路[41]。

研究发现移植24h后人脐带间充质干细胞向正常侧和损伤侧迁移，人神经干细胞向损伤侧迁移，人脐带间充质干细胞迁移量明显多于人神经干细胞，推测与早产儿脑白质损伤后神经炎症的激活有关。神经炎症涉及小胶质细胞和内皮细胞的活化，导致促炎细胞因子和内皮黏附分子的分泌，并与血管紧密连接修饰相关[42]。受损的微血管可能通过血脑屏障，将活化的白细胞招募到脑损伤部位，导致持续的神经炎症，进一步损伤大脑[43]。人脐带间充质干细胞通过抑制促炎细胞因子的转录和分泌以及抑制小胶质细胞的积累来减少神经炎症[44]。此外，人脐带间充质干细胞不表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子和共刺激分子，阳性表达人白细胞抗原G等免疫抑制剂，表现出极低的免疫原性和诱导宿主免疫耐受微环境的潜力[45]，因此人脐带间充质干细胞可能对大鼠缺血缺氧后急性期内环境的改变更耐受。整个研究结果表明人脐带间充质干细胞和人神经干细胞在早产儿脑白质损伤大鼠模型中经鼻黏膜路径是可行的，经鼻滴注细胞可作为一种新型的治疗早产儿脑白质损伤的手段，这将为干细胞经鼻移植路径应用于临床治疗早产儿脑白质损伤提供了初步的理论依据。

大脑对于异种组织移植产生排斥反应，而且供体和宿主之间的系统发育距离越远，排斥反应过程就越快[46]。研究表明环孢素A通过抑制线粒体通透性转变孔发挥神经保护作用[47,48,49]，能够影响异体移植细胞的存活，但不影响细胞的分化能力[46]。该研究中大鼠移植前3d直至观察点均采用腹腔注射环孢素A，减少免疫排斥作用对细胞存活的影响，但是关于环孢素A是否影响细胞的迁移尚不清楚。

如何优化移植细胞的剂量、移植的次数、移植的时间等条件以提高细胞移植的有效性，仍有待进一步研究。该研究仅仅从移植后24h观察细胞在早产儿脑白质损伤模型中的迁移情况，下一步还需要探讨以下问题：(1)干细胞经鼻移植后促进神经修复的最佳剂量，加大单次注入的细胞剂量还是多次重复注入；(2)经鼻移植过程中是否应该配合使用血管收缩剂或吸收促进剂以增强细胞的吸收；(3)细胞移植的最佳时间窗，急性期取材时间点是否应该增加；(4)此外，活体生物发光成像技术具有实时动态监测、高灵敏度、高特异性等优点，可用于监测移植的干细胞在体内存活、迁移和增殖等情况[50]。是否可以用荧光素酶基因标记细胞来更好地监测和示踪细胞呢？这些都需要进一步探讨。在后续的实验中将探讨经鼻移植人脐带间充质干细胞和人神经干细胞对早产儿脑白质损伤的功能恢复和神经保护作用。

作者贡献：该研究为中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室和南通大学附属医院儿科合作，实验设计为第一作者和共同第一作者，实验实施为第一、二、三、四作者，实验评估为第五作者和通讯作者，资料收集为第一作者。

经费支持：该文章接受了“国家重点研发计划(2017YFA0104200)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：该研究的实施符合中国人民解放军总医院第六医学中心的相关伦理要求(20170812，批准时间2017-09-10)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

知情同意问题：所取标本来源于中国人民解放军总医院第六医学妇产科、儿科，经患者和相关家属知情同意，并签署知情同意书。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计方法已经通过军事科学院军事医学研究院统计教研室专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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图1|人脐带间充质干细胞和人神经干细胞的形态学特征(A：×100,B-D：×200)

图4|脑白质损伤造模后两侧髓鞘碱性蛋白的免疫荧光染色(标尺为100μm)

图2|人脐带间充质干细胞体外成脂分化鉴定(×200)

图注：成脂分化第20天，油红O染色可见脂滴被染成红色(×200)

图3|人脐带间充质干细胞和人神经干细胞的体外迁移情况(标尺为50μm)

图注：图中A为人脐带间充质干细胞迁移后DAPI染色图；B为人神经干细胞迁移后DAPI染色图

图5|脑白质损伤造模后两侧髓鞘碱性蛋白(MBP)表达量

图6|经鼻移植人脐带间充质干细胞和人神经干细胞在大鼠脑内迁移情况(A-F标尺为50μm,G-I标尺为100μm)

图注：图中A-F为人脐带间充质干细胞抗人核免疫组化染色图；G-I为人神经干细胞荧光染料标记图。红色区域为示踪到的细胞，左上角为红色区域放大图

臧静,栾佐,王倩,杨印祥,汪兆艳,吴尤佳,郭爱松.两种干细胞经鼻移植治疗大鼠早产儿脑白质损伤[J].中国组织工程研究,2021,25(01):101-107.

基金:国家重点研发计划(2017YFA0104200),项目负责人:栾佐.