沙枣(Elaeagnus angustifoliaL.)又名七里香、桂香柳等，在新疆作为防风林树种广泛种植。沙枣树的果实、花、叶等均具有较高的营养价值[1],被誉为“宝树”。近年来，随着人们健康意识的增强，对具有提升免疫功能等特性的功能性植物食品的需求明显增加[2]。多酚类化合物是广泛存在于中草药或植物食品中的生物活性分子[3],具有抗氧化、抗诱变、抗肿瘤、抗辐射、抑菌[4]、抗腹泻[5]、抗炎镇痛等作用。赵仲霞等[6]研究发现，黑糖总多酚的体外抗氧化活性高于没食子酸标准品，适于日常食用。李静等[7]研究发现，短时黑蒜多酚具有较强的体外抗氧化活性，可进一步开发为功能性食品。杨子明等[8]研究了荔枝皮多酚对小鼠体内抗氧化活性的影响，发现荔枝皮多酚及其酸解、碱解产物均具有一定的抗氧化活性。刘迪等[9]研究发现，核桃青皮多酚具有显著的体内抗氧化活性。目前，关于沙枣叶多酚提取工艺的研究较少，因此，作者采用超声辅助法提取新疆沙枣叶多酚，在单因素实验的基础上，利用响应面法对沙枣叶多酚的提取工艺进行优化，并通过测定沙枣叶多酚对DPPH自由基的清除能力及对小鼠血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)的影响评价其抗氧化活性，拟为新疆沙枣叶的资源化开发利用提供理论依据。

1、实验

1.1 材料、试剂与仪器

沙枣叶(粉碎，过80目筛),采自新疆克拉玛依白碱滩，经新疆医科大学鉴定为胡颓子科植物沙枣(Elaeagnus angustifoliaL.)的干燥叶。SPF级昆明小鼠，体重20～25 g, 合格证号：SCXK(新)2018-002,新疆医科大学实验动物中心。

乙醇、无水碳酸钠，天津致远化学试剂有限公司；福林酚，上海麦克林生化科技有限公司；没食子酸对照品，北京索莱宝科技有限公司；丙二醛测试盒(A003-1)、总抗氧化能力测试盒(A015-2-1)、超氧化物歧化酶测试盒(A001-3)、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒(A005-1),南京建成生物工程研究所。

UV-2700型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HH-S4型数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；500A型多功能粉碎机，永康松青五金厂；AB135-S型分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ500DE型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；全波长酶标仪，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.2 沙枣叶多酚的提取

称取沙枣叶粉末0.5 g, 按料液比1∶50(g∶mL,下同)加入40%乙醇，200 W超声提取1 h, 过滤，即得沙枣叶多酚提取液。

1.3 沙枣叶多酚含量的测定

标准曲线的绘制：用纯化水配制浓度为0.1 mg·mL-1的没食子酸对照溶液；分别移取0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL的没食子酸对照溶液于10 mL容量瓶中，加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液和0.5 mL福林酚试剂，定容；置于75 ℃恒温水浴锅中，反应10 min后，测定760 nm处吸光度。以没食子酸浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线[10](图1),拟合得线性回归方程：A=114.6c-0.0914(R2=0.9987)。

吸取1.0 mL稀释后的沙枣叶多酚提取液，按上述方法测定760 nm处吸光度，根据标准曲线方程计算多酚含量。

1.4 沙枣叶多酚提取工艺的优化

以沙枣叶多酚含量为评价指标，采用单因素实验考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,g∶mL)、乙醇体积分数(20%、30%、40%、50%、60%)、提取时间(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、提取功率(100 W、200 W、300 W、400 W、500 W)对沙枣叶多酚含量的影响。

图1 没食子酸的标准曲线

选择料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)和提取功率(D)为考察因素，利用Design-Expert 13软件设计4因素3水平响应面实验，进一步优化沙枣叶多酚的提取工艺。

1.5 沙枣叶多酚的体外抗氧化活性评价

1.5.1 溶液的制备

VC溶液：精密称取107.04 mg VC,置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，避光处保存，备用。

DPPH自由基溶液：精密称取4.42 mg DPPH,置于100 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，避光处保存，备用。

供试溶液：称取沙枣叶粉末约1 g, 按料液比1∶40加入58%乙醇，250 W超声21 min, 过滤，收集上清液，即得供试溶液。

1.5.2 沙枣叶多酚对DPPH自由基的清除能力

将供试溶液用58%乙醇稀释至浓度(mg·mL-1)分别为0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20的样品溶液；移取各浓度样品溶液1 mL于试管中，加入DPPH自由基溶液1 mL,混匀，避光反应30 min, 测定517 nm处吸光度；以VC为对照，平行测定3次。按式(1)计算DPPH自由基清除率：

清除率

式中：A1为1 mL DPPH+1 mL样品溶液的吸光度；A2为1 mL DPPH+1 mL 58%乙醇的吸光度；A3为1 mL样品溶液+1 mL 58%乙醇的吸光度。

1.6 沙枣叶多酚的体内抗氧化活性评价

1.6.1 样品制备

称取适量沙枣叶粉末，按料液比1∶40加入58%乙醇，250 W超声21 min, 过滤，收集上清液，浓缩蒸干，得到干浸膏，制成0.16 g·mL-1、0.08 g·mL-1、0.04 g·mL-1的混悬液，必要时可微加热以加速溶解。临用前配制，每次灌胃前摇匀后使用。

1.6.2 模型的建立

取SPF级雄性昆明小鼠50只，随机均分成5组：1个空白对照组，给予生理盐水0.01 mL·g-1;1个模型对照组，给予生理盐水0.01 mL·g-1;3个给药组，即低剂量组(0.4 g·kg-1)、中剂量组(0.8 g·kg-1)、高剂量组(1.6 g·kg-1),每日灌胃1次，每只小鼠灌胃量均为0.01 mL·g-1,连续灌胃15 d。末次灌胃后，模型对照组和3个给药组禁食16 h (过夜),然后一次性灌胃给予50%乙醇(12 mL·kg-1),6 h后摘取眼球取血，立即脱颈处死，迅速摘取心脏、肝脏、脾脏和肾脏，用生理盐水洗净，吸干水分并称重，按式(2)计算脏器系数；全血4 000 r·min-1离心10 min后取血清，-80 ℃冻存。空白对照组不作处理，不禁食取血。

脏器系数

1.6.3 指标检测

MDA含量反映了细胞脂质过氧化程度，常被用作生物脂质过氧化反应的检测指标[11]。SOD是机体主要的抗氧化酶，保护细胞免受氧化应激损伤[12]。GSH-Px是体内重要的一种催化酶，可阻断脂质过氧化反应，减少过氧化产物的生成，从而保护细胞膜[13]。T-AOC是评估机体氧化应激的重要指标[14]。按照试剂盒说明书检测血清中MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC的表达水平。

1.7 数据处理

实验结果以平均值±标准差

表示，使用SPSS 27.0软件行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。

2、结果与讨论

2.1 方法学考察

精密度实验：移取适量没食子酸对照溶液，按1.3方法测定吸光度，重复测定6次， 其RSD值为0.352%。表明该仪器精密度良好。

重复性实验：称取6份沙枣叶粉末各0.5 g, 按1.2方法制备沙枣叶多酚提取液，按1.3方法测定吸光度， 其RSD值为3.885%。表明该方法的重复性较好。

稳定性实验：取0.5 mL沙枣叶多酚提取液，按1.3方法分别在15 min、30 min、60 min、90 min、120 min测定吸光度，其RSD值为1.064%。表明沙枣叶多酚提取液在120 min内稳定性较好。

加标回收率实验：按1.2方法平行制备沙枣叶多酚提取液6份，分别加入0.1 mg·mL-1的没食子酸对照溶液，按1.3方法测定吸光度，计算得到平均加标回收率为97.7%, RSD值为1.75%,符合药典规定。表明该方法的准确度较高。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对沙枣叶多酚含量的影响(图2)

图2 料液比对沙枣叶多酚含量的影响

由图2可知，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，沙枣叶多酚含量先升高后降低并趋于稳定，当料液比为1∶30时，多酚含量最高。说明溶剂用量过多会抑制多酚的溶出[15]。因此，选择1∶30作为响应面实验料液比的中心点。

2.2.2 乙醇体积分数对沙枣叶多酚含量的影响(图3)

图3 乙醇体积分数对沙枣叶多酚含量的影响

由图3可知，随着乙醇体积分数的增加，沙枣叶多酚含量逐渐升高，当乙醇体积分数为50%时，多酚含量最高，为29.804 mg·g-1;继续增加乙醇体积分数，多酚含量降低，可能是因为，乙醇体积分数过大时，沙枣叶多酚的溶解度随着溶剂极性降低而下降，导致多酚含量降低[16]。 因此，选择50%作为响应面实验乙醇体积分数的中心点。

2.2.3 提取时间对沙枣叶多酚含量的影响(图4)

图4 提取时间对沙枣叶多酚含量的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，沙枣叶多酚含量逐渐升高，当提取时间为30 min时，多酚含量达到最高，为33.469 mg·g-1;继续延长提取时间，多酚含量逐渐下降，可能是由于，提取时间延长时，一方面沙枣叶多酚的结构被破坏[17],另一方面沙枣叶中的其他杂质被溶出，导致多酚含量降低；当提取时间进一步延长至50 min后，多酚含量呈小幅升高，可能是由于，鞣质和黄酮类化合物均含有多酚结构，提取时间过长时，会促进这些物质的释放，导致多酚含量小幅升高。因此，选择30 min作为响应面实验提取时间的中心点。

2.2.4 提取功率对沙枣叶多酚含量的影响(图5)

图5 提取功率对沙枣叶多酚含量的影响

由图5可知，当提取功率为300 W时，沙枣叶多酚含量达到最高，为33.207 mg·g-1;继续增大提取功率，多酚含量持续下降。可能是由于，超声处理后沙枣叶结构变得松散，促使多酚类物质释放[15];但提取功率过大时，多酚结构被破坏，导致多酚含量降低[18]。因此，选择300 W作为响应面实验提取功率的中心点。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计与结果(表1)

表1 响应面实验设计与结果

2.3.2 模型方程的建立与方差分析

利用Design-Expert 13软件对表1数据进行拟合，得到回归模型方程为：Y=30.20+0.581A+0.5348B+0.9018C-0.5127D+0.6555AB+0.6545AC-0.1745AD-1.72BC-0.4087BD+0.3438CD-0.3866A2-1.78B2+0.7699C2-0.5386D2。

回归模型的方差分析如表2所示。

表2 回归模型的方差分析

由表2可知，该模型的P<0.0001,极显著；失拟项的P=0.2654>0.05,不显著，说明实验误差较小，该模型拟合较好；该模型的R

=0.8951,说明实际值与理论预测值的拟合程度较好；变异系数CV=4.63%<10%,说明实验结果的精确度和可靠性较高，可以利用该模型来最大限度地提取沙枣叶多酚。回归模型的显著性检验显示，一次项A、二次项B2对沙枣叶多酚含量的影响极显著，一次项C、交互项BC的影响显著。由F值可知，各因素对沙枣叶多酚含量影响的大小顺序为：A(料液比)>C(提取时间)>B(乙醇体积分数)>D(提取功率)。

2.3.3 各因素交互作用的响应面分析

各因素交互作用对沙枣叶多酚含量影响的响应面图及等高线图如图6所示。

响应曲面坡度越大，说明其对应的因素对响应值的影响越大；等高线越接近椭圆形，两因素之间的交互作用越显著[19]。由图6可知，乙醇体积分数与提取时间交互作用的响应曲面坡度较陡峭，表明两者交互作用显著(P<0.05)。根据表2中各项的F值，可知两者交互作用对沙枣叶多酚含量影响的大小顺序为：BC>AB>AC>BD>CD>AD,其中乙醇体积分数与提取时间的交互作用的影响最大。

图6 各因素交互作用对沙枣叶多酚含量影响的响应面图及等高线图

2.3.4 最佳工艺条件的预测及模型验证

利用Design-Expert 13 软件分析得到沙枣叶多酚的最佳超声提取工艺为：料液比1∶39.6、乙醇体积分数57.688%、提取时间21.32 min、提取功率245.61 W,沙枣叶多酚含量的预期值为36.21 mg·g-1。考虑实际情况，将最佳提取工艺调整为：料液比1∶40、乙醇体积分数58%、提取时间 21 min、提取功率250 W, 在此条件下进行3次平行验证实验，沙枣叶多酚的平均含量为 36.45 mg·g-1,与预期值接近，验证了该模型的准确性。

2.4 沙枣叶多酚的体外抗氧化活性

沙枣叶多酚对DPPH自由基的清除能力如图7所示。

由图7可知，随着浓度的增加，沙枣叶多酚对DPPH自由基的清除率整体呈升高趋势。当浓度为0.20 mg·mL-1时，沙枣叶多酚、VC对DPPH自由基的清除率相差不大，分别为90.3%、96.5%。说明沙枣叶多酚对DPPH自由基有较强的清除能力。

2.5 沙枣叶多酚的体内抗氧化活性

2.5.1 沙枣叶多酚对小鼠血清中 MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC 水平的影响(表3)

图7 沙枣叶多酚对DPPH自由基的清除能力

表3 沙枣叶多酚对小鼠血清中 MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC水平的影响

2.5.2 沙枣叶多酚对小鼠脏器系数的影响(表4)

肾脏系数、肝脏系数可以在一定程度上反映药物对肾脏、肝脏的损害，如果2个指标均降低，说明代谢能力受药物影响[8]。由表4可知，模型对照组小鼠的肾脏系数和肝脏系数与空白对照组差异极显著 (P<0.01),说明小鼠的肾脏和肝脏受到了一定损害，代谢能力受到影响。高、中、低剂量组小鼠的肾脏系数和肝脏系数与模型对照组无显著差异(P>0.05)。

表4 沙枣叶多酚对小鼠脏器系数的影响

3、结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法优化了沙枣叶多酚的提取工艺。确定最佳提取工艺为：料液比1∶40(g∶mL)、乙醇体积分数 58%、提取时间21 min、提取功率250 W,在此条件下，沙枣叶多酚含量为36.45 mg·g-1。沙枣叶多酚具有较强的体内外抗氧化活性。当浓度为0.20 mg·mL-1时，沙枣叶多酚对DPPH自由基的清除率为90.3%;与模型对照组比较，沙枣叶多酚高剂量组小鼠血清中MDA水平极显著降低(P<0.01),SOD、GSH-Px、T-AOC的水平均极显著升高(P<0.01),且肾脏系数和肝脏系数与模型对照组无显著差异(P>0.05)。

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基金资助:国家自然科学基金地区科学基金项目(81860772); 新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2022D01C453);

文章来源:张小庆,苏伟航,孙芸,等.响应面法优化沙枣叶多酚提取工艺及体内外抗氧化活性研究[J].化学与生物工程,2024,41(09):15-22.