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木犀草素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

2024-11-11 3 上传者：管理员

摘要：目的探讨木犀草素(Luteolin)对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的影响。方法 30只SD大鼠(SPF级、雄性)以随机数字原则分为假手术组(Sham组，0.9%NaCI,4 mg/kg)、模型组(I/R组，0.9%NaCI,4 mg/kg)木犀草素给药组(Luteolin组，4 mg/kg)各10只，灌胃给药，共7 d。I/R组和Luteolin组采用结扎心脏左冠脉左前降支30 min,再灌注2 h构建MIRI模型。Sham组和I/R组给予同Luteolin组相同剂量的生理盐水。比较3组动态心电图(ECG)区别；血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白(cTn)I含量检测用酶联免疫吸附试验(ELISA);免疫组织化学法检测心肌组织中Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)1和肌球蛋白轻链(MLC2)表达。结果与Sham组比较，I/R组ECG中ST段抬高，CK-MB和cTnI水平升高，ROCK1和MLC2蛋白表达水平均升高，差异显著(P<0.05)。与I/R组比较，Luteolin组ECG中ST段相对下移，CK-MB和cTnI水平下降，ROCK1和MLC2蛋白表达水平均下降，差异显著(P<0.05)。结论木犀草素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏具有保护作用，可能是通过抑制RhoA/ROCK信号通路中ROCK1和MLC2蛋白表达发挥心脏保护作用。

关键词：
Rho相关螺旋春曲蛋白激酶
心肌缺血再灌注损伤
心血管病
木犀草素
肌球蛋白轻链
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随着人们生活习惯改变和生活工作压力的增加，心血管病病死率一直居高不下，最常见的原因就是心肌缺血[1]。临床上常用药物溶栓和经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的方式缓解心肌的缺血症状。但是，随之而来的就是心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的问题。MIRI是指心脏短暂缺血后恢复血流时所发生的凋亡、炎症、氧化应激和钙超载等一系列病理过程，MIRI是一个重要的临床问题，尚缺乏有效的治疗方案。木犀草素(Luteolin)是一种广泛存在于水果、蔬菜、中草药(苹果、辣椒、金银花等)中的植物化学物质，其属于黄酮类化合物。Leuteolin属于天然抗氧化剂，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗糖尿病等作用[2,3]。目前对于MIRI的保护机制尚待深入研究。RhoA/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)信号通路是机体一种基础信号通路，有研究报道该通路在心脏内皮细胞和心肌细胞有表达。本文基于RhoA/ROCK信号通路探究Luteolin对MIRI大鼠MIRI的影响。

1、材料与方法

1.1 实验动物

由长春亿斯实验动物技术有限公司购买的SD大鼠[SPF级、雄性、体质量200～220 g、动物合格证号为01021688112534247、使用许可证号为SYXK(黑)2021-018]30只，行自由饮水与进食，并经适应新喂养后开始实验操作。本研究已经过佳木斯大学伦理委员会(JMSU-227)通过。

1.2 药品、试剂及仪器

Luteolin(纯度≥98%)购自西安汇林公司；血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒和肌钙蛋白(cTn)I检测试剂均购自盒南京建成；BL-420I生物信号采集放大系统购置成都泰盟科技有限公司；ROCK1、肌球蛋白轻链(MLC)2抗体购自Affinity公司；辣根过氧化物酶(HRP)/羊抗兔IgG购自中杉金桥公司；戊巴比妥钠购自天津施维雅制药有限公司；注射用青霉素购自哈药集团制药总厂；各类眼科用手术器械。

1.3 分组与给药

依据随机数字原则将30只大鼠分成假手术(Sham)组、模型组(I/R)组、Luteolin给药(Luteolin)组。Luteolin组提前7 d给予Leuteolin(4 mg/kg)灌胃，而Sham组与I/R组均按4 mg/kg剂量用生理盐水于相同时间点灌胃。

1.4 MIR模型建立

大鼠取仰卧位固定于手术台上，采取腹腔注射戊巴比妥钠溶液(浓度为2.5%、剂量按30 mg/kg)麻醉，切开颈部皮肤，分离颈部肌肉，暴露气管并切开。连接好气管插管后和呼吸机相连，并调整各项呼吸参数(呼吸频率为80次/min, 潮气量为6.0,呼吸比为5∶4)。连接BL-420生物信号采集放大系统的心电电极后，监测心肌缺血及再灌注的典型动态心电图(ECG)变化。碘伏消毒胸部皮肤后于左侧第4～5肋间隙打开胸腔并暴露心脏，用眼科剪刀剪破心包膜后持5～0无菌手术线穿过左冠状动脉前降支(LAD)中远段系活结结扎(结扎厚度不可过厚),引起心肌缺血30 min, 发现心尖部位发白及ECG ST段明显抬高表示构建心肌缺血成功。将结扎线松开，给予再灌注120 min, 发现心尖发白部位颜色有所变红及心电图ST段有所回落表示MIRI模型构建成功。

1.5 样本采集与处理

MIRI模型构建成功后取腹主动脉采血在4 ℃下以4 000 r/min离心15 min后取上层血清，于-80 ℃保存备用；并将各组大鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定，用以免疫组织化学检测。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清CK-MB、cTnI水平

将离心后的血清取出待测CK-MB、cTnI水平，具体操作步骤严格按照ELISA操作说明书执行。

1.7 免疫组化法检测通路相关蛋白表达

把经甲醛固定的大鼠心脏组织切成厚约为5 μm 的玻片(脱水、脱蜡、包埋、切片、捞片、烘片、摊片等操作步骤),经封片后显微镜下观察。具体操作步骤为：脱蜡(二甲苯)、酒精脱水(按不同梯度进行)、修复[乙二胺四乙酸(EDTA)或柠檬酸均可]、冲洗[用磷酸盐缓冲液(PBS)进行缓冲]、采取内源性过氧化物酶进行阻断、分别孵育(以一抗、二抗进行)、复染、返蓝(以流水操作)、干燥等步骤。

1.8 统计学分析

采用SPSS27.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2、结果

2.1 Luteolin对MIRI大鼠ECG的影响

与Sham组相比，I/R组ECG的ST-T段弓背向上明显抬高；与I/R组相比，Luteolin组ECG的ST-T段弓背向上抬高的幅度明显下降。见图1。

图1 各组ECG变化

2.2 Luteolin对MIRI大鼠心肌损伤指标的影响

与Sham组相比，I/R组血清CK-MB、cTnI 水平显著升高(P<0.001);与I/R组相比，Luteolin组血清CK-MB、cTnI水平明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3 Luteolin对MIRI大鼠心肌组织中RhoA/ROCK信号通路蛋白表达的影响

与Sham组相比，I/R组心肌组织中MLC2、ROCK1 蛋白表达水平显著升高(P<0.001);与I/R组相比，Luteolin组心肌组织中MLC2、ROCK1蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。见表1、图2。

表1 各组血清CK-MB、cTnI水平及心肌组织中MLC2、ROCK1蛋白表达水平

与Sham组相比：1)P<0.05,2)P<0.01;3)P<0.001;与I/R组相比：4)P<0.05,5)P<0.01,6)P<0.001

图2 各组心肌组织MLC2、ROCK1蛋白表达(免疫组化染色，×400)

3、讨论

MIRI是一个复杂的病理过程，涉及多种因素。钙超负荷、氧化应激损伤、炎症反应和心肌细胞凋亡是再灌注后MIRI的主要机制[4]。而出现心功能障碍的主要原因是能够引起心肌损伤机制之一的细胞凋亡。其广泛存在于各个器官系统疾病中。CK-MB是特异性心肌酶，当其受到较大损害后，CK-MB 会大量向胞外释放。因此，CK-MB 可作为评判心肌损伤的标志性指标之一[5]。调节心肌收缩的重要蛋白就是由3个亚基cTnT、cTnI和cTnC组成的cTn, 其中cTnI被常用于评估心肌损伤[6]。当心肌受损出现胞膜破裂时就会造成胞内酶释放，因而常用血清中CK-MB和cTnI水平作为判定心肌损伤与严重程度的敏感指标。Luteolin是一种广泛存在于水果、蔬菜、中草药(苹果、辣椒、金银花等)中的植物化学物质，是具有于多种药理活性的黄酮类化合物[7]。该化合物已被证明具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和保肝等特性。本研究说明，Luteolin能够通过减轻心肌损害来保护心肌。Luteolin可以减弱心肌缺血和损伤程度，也进一步验证了ECG中ST段代表的生理意义(反映缺血和损伤程度的轻重)。本文结果表明，Luteolin对MIRI大鼠心肌具有保护作用，可能是通过降低酶学指标、降低ST段发挥作用。

RhoA是Rho家族(小分子G蛋白家族)最重要的成员之一，Rho家族的主要功能因其在调节真核生物中肌动蛋白的细胞骨架中的关键作用而广为人知。其主要参与完成细胞运动和运输及细胞的骨架重排、吞噬作用等多种细胞功能活动[8]。RhoA通常有两种形式存在，即与三磷酸鸟苷(GTP)结合的活性形式和与鸟嘌呤二核苷酸磷酸(GDP)结合的非活性形式，并且发挥细胞功能作用时只有活性形式与下游靶点蛋白结合才有效；这其中匹配度最高的下游关键靶点蛋白就是ROCK。研究发现，RhoA/ROCK通路可参与中枢神经系统疾病(包括脑炎、脑卒中等)的发生发展[9];而降低或减弱神经炎症及损伤可通过抑制该通路发挥作用[10,11]。RhoA/ROCK通路主要通过抑制肌球蛋白磷酸酶促进激动剂介导的收缩，从而增加磷酸化MLC2[12]。ROCK有ROCK1(主要存在于心脏等非神经组织中)和ROCK2(表达于大脑和脊髓)[13]两种亚型。在氧化应激损伤中发挥作用可通过RhoA/ROCK通路，该通路还参与调节细胞的多种生命活动(比如细胞增殖、黏附、迁移、形态、生长发育等),对于癌细胞的转移也有影响[14,15]。研究报道，茯苓多糖调控 Rho/ROCK信号通路对MIRI大鼠心肌细胞凋亡的影响，证实该通路与MIRI发病机制中的氧化应激和炎症反应密切相关[16],并且可以诱导心肌损伤和心肌细胞的凋亡。

本研究表明，心肌缺血缺氧后可能激活了RhoA/ROCK通路，还可能是激活了氧化应激发挥作用。提示Luteolin可以通过降低减LMC2、ROCK1蛋白表达来减弱心肌缺血和损伤程度，进而达到对心脏的保护作用。从另一角度看，RhoA/ROCK通路有望成为MIRI治疗的新靶点，也为MIRI的中医中药治疗提供理论依据。本研究中只是单独研究了体内动物实验，有关体外细胞实验及RhoA/ROCK通路蛋白间的相关性研究尚未阐述，均有待在后续研究中完善。

综上，Luteolin能有效改善结扎左冠状动脉建立的MIRI对大鼠心脏造成的损伤，其机制可能是通过调节RhoA/ROCK通路介导的氧化应激而发挥作用。

参考文献:

1王杰,范凯,何岤,等.一种新型丹神素/四甲基吡嗪可预防大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].国际医学科学杂志,2021;18(12):2716-24.

5贺春艳,李丹,张燚格,等.电针预处理通过调控AKT/mTOR信号通路减轻缺血再灌注大鼠心肌损伤[J].吉林中医药,2024;44(5):529-32.

6朱雅萍,魏金聚.右美托咪定复合瑞芬太尼对心内直视手术心肌缺血再灌注后血流动力学及肌钙蛋白和肌酸激酶-工酶的影响[J].医药论坛杂志,2024;45(5):529-32,537.

13谢骏,王媛媛,李聚鑫,等.茯苓多糖调控 Rho-ROCK 信号通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响和机制研究[J].中国中药杂志,2023;9(11):1-7.

基金资助:黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究团队项目(2022-KYYWF-0656);黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2022H091);

文章来源:李强,薛晴,曹红,等.木犀草素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5320-5323.