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RP-HPLC法快速测定常山胡柚果皮中3种主要成分

2024-11-18 89 上传者：管理员

摘要：目的建立常山胡柚果皮中3种主要成分的含量测定方法。方法采用RP-HPLC法测定含常山胡柚果皮中芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量，色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250mm,5μm），流动相为甲醇（A）-0.1%乙酸-水溶液（B），流速为1.0mL·min-1，于283nm波长下检测，柱温35℃，进样量5μL。结果常山胡柚果皮中芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷在一定范围内线性良好（r>0.9992）。结论该法操作简便，灵敏度高，检测快速，适用于常山胡柚果皮中黄酮类成分的含量测定。

关键词：
反向-高效液相色谱
常山胡柚
新橙皮苷
柚皮苷
芸香柚皮苷
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芸香科植物常山胡柚Citrus aurantium‘Changshan-huyou’（常山柚橙Citrus Changshanhuyou Y.B.Chang），主产于浙江省衢州市常山县，其干燥未成熟果实衢枳壳作为地方习用中药收载于《浙江省中药炮制规范》2015年版，并入选新“浙八味”和“衢六味”道地中药材目录[1,2]。胡柚皮是常山胡柚的干燥成熟果皮，具有降血脂、降血糖、抗脂肪肝和抗氧化等生理活性。胡柚皮富含黄酮类成分，包括柚皮苷、新橙皮苷、橘皮素和甜橙素等[6-8]。胡柚皮是一种具有开发潜力的中药材，急需精准、便捷的质量控制研究基础。为此，本文采用反向-高效液相色谱（RP-HPLC）法测定胡柚皮中主要成分的含量，建立一种稳定可靠、方法和操作简单的黄酮类成分含量测定方法，可应用于胡柚皮黄酮类成分含量的测定，为胡柚皮的质量控制和深入开发提供参考。

1、实验部分

1.1仪器

1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；ME204E型万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB25-12DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；micro17R型冷冻离心机（美国Thermo公司）；Gen PureTMx CAD Plus型纯水仪（美国Thermo公司）。

1.2试药

常山胡柚采摘于常山县各地区，经衢州市食品药品检验研究院徐礼萍鉴定。柚皮苷（批号：110722-202116）、新橙皮苷（批号：111857-201102），中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷（批号：250107-202110上海鸿永生物科技有限公司），上述标准品纯度均≥98%。甲醇、冰乙酸，均为色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水为超纯水。

1.3实验方法

1.3.1色谱条件

安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm,5μm）；甲醇（A)-0.1%乙酸-水溶液（B）梯度洗脱，洗脱条件为30%～50%A,0～20min；检测波长283nm；柱温：35℃；流速：1.0m L·min-1；进样量：对照品5μL，供试品5μL。

1.3.2对照品溶液的制备

精密称取3种对照品适量，加70%甲醇溶剂制成浓度为1.0114mg·m L-1（柚皮苷）、1.0188mg·m L-1（新橙皮苷）、0.10457mg·m L-1（芸香柚皮苷）的混合溶液，即得。

1.3.3供试品溶液的制备

精密称取样品粉末约0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10m L，密塞，称定重量。30℃超声60min，冷却至室温，再次称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，涡旋混匀，以13000r·min-1转速离心10min，取上清液，即得。

2、结果与讨论

2.1样品提取及仪器操作条件的确定

2.1.1提取条件的优化

根据前期预实验，分别对不同溶剂（纯水、50%甲醇、70%甲醇和纯甲醇）、提取方式（超声提取法和回流提取法）及提取时间（30、60、90min）等因素进行考察，结果见表1。

表1 提取条件选择结果（mg·g-1)

由表1可见，最终确定以70%甲醇、超声提取90min为提取胡柚皮黄酮类主要成分的最佳条件。

2.1.2检测波长的选择

应用紫外检测器，对样品中有紫外吸收的目标化合物进行多个波长的扫描，分析芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷3个化合物在195～400nm范围内的紫外扫描吸收光谱，其中代表性波长色谱图见图1。

根据色谱图各检测峰峰面积大小，并参考2020版《中国药典》近似药材方法并结合相关文献，最终确定检测波长为283nm[9,10]。

图1 主要波长下的胡柚皮样品色谱图

2.1.3柱温的选择

根据前期预实验，考察25、30、35℃3种柱温对检测谱图的影响，结果发现，柱温对实验结果的影响不明显，考虑到耐用性和稳定性问题，最终选择柱温为35℃进行检测。

2.2方法考察

2.2.1线性关系考察

分别精密吸取芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷对照品贮备液适量，制成线性梯度浓度的标准曲线溶液。采用上述分析方法进样测定。以待测物质量浓度为横坐标（X），待测物峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程，结果见表2。

表2 各待测成分线性关系

2.2.2专属性实验

取适当浓度的混合对照品溶液和供试品溶液适量，采用上述分析方法进样测定，结果见图2。

图2 胡柚皮HPLC色谱图

由图2可见，各成分分离效果较好。

2.2.3精密度实验

取混合对照品溶液5μL，连续进样6次，按1.3.1项下测定芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的峰面积，结果见表3。

表3 精密度测定结果（n=6)

由表3可见，芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的RSD(n=6）分别为1.86%、2.42%、2.33%，表明该方法精密度良好。

2.2.4重复性实验

取同一批胡柚皮药材样品（S6)6份，按1.3.3项下方法制备供试品溶液，测定3种成分的峰面积，结果见表4。

表4 重复性测定结果（n=6)

由表4可见，芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷重复性实验的RSD(n=6）分别为1.25%、0.82%、1.41%，表明该方法有良好的重复性。

2.2.5稳定性实验

取同一批胡柚皮药材样品（S6）供试品溶液，分别于0、2、6、10、12、24h进样5μL，准确记录芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的峰面积，结果见表5。

表5 稳定性测定结果

由表5可见，芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷稳定性实验的RSD分别为1.85%、1.38%、0.68%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.6加样回收率实验

取已知含量的胡柚皮供试品粉末6份，每份各约50mg，采用分析天平精密称定后，分别置于10m L锥形瓶中制备供试品溶液。再准确加入一定量的芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷对照品，制备标准品溶液，按1.3.1项下方法测定，结果见表6。

表6 回收率测定结果（n=6)

由表6可见，该分析方法的准确度良好。

2.3样品测定

共收集13批不同产地胡柚皮药材样品，根据上述分析方法测定13批样品中芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量，结果见表7。

由表7可见，检测样品均收集于常山胡柚的主要产地常山县，所测样品中柚皮苷含量范围为10.475～17.957mg·g-1，新橙皮苷含量范围为12.392～19.213mg·g-1，二者的含量相对较高，可作为常山胡柚果皮药材的质控类成分。

表7 不同产地胡柚皮中3种主要成分的含量（mg·g-1,n=3)

3、结论

本实验首次建立了RP-HPLC法同时测定常山胡柚果皮药材中3种主要成分芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷含量的方法。重点对提取条件、检测波长等条件进行了优化，最终该方法可在20min内对上述成分进行快速分析。结果表明，所建立的方法简便快速，稳定可靠，能有效应用于常山胡柚果皮的质量评价，以此为常山胡柚果皮的深入开发提供科学可靠的依据。

参考文献:

[1]浙江省食品药品监督管理局.浙江省中药炮制规范[S].北京:中国医药科技出版社, 2015.

[2]许守超,陈屠梦,包绍印,等.衢枳壳的药理作用研究进展[J].中国高新科技, 2019,(10):26-28.

[5]施政.胡柚皮黄酮调控Nrf2-ARE信号通路治疗非酒精性脂肪性肝病的作用及其机制研究[D].浙江中医药大学, 2023.

[6]方健,吴晓宁,蒋剑平,等.常山胡柚皮黄酮类成分指纹图谱与其抗氧化活性的谱效关系研究[J].中国现代应用药学, 2018,35(10):1489-1493.

[7]郅景梅,王敏. HPLC法测定胡柚皮中多甲氧基黄酮类成分的含量[J].中医药信息, 2013, 30(2):26-27.

[8]曾惠明,徐天有,石玲丽,等.胡柚皮中类黄酮素提取及残渣综合利用工艺研究[J].安徽农业科学, 2019, 47(14):185-187.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版一部)[M].北京:中国医药科技出版社, 2020.

[10]吴群,孙建城,张姬雯,等.衢州主要柑桔青果果皮6种黄酮类化合物含量变化和差异研究[J].中国南方果树, 2022, 51(6):43-46.

基金资助:常山县基层农技推广体系改革与建设补助项目(2022);衢州市科技攻关项目(2022K109);

文章来源:周一军,黄志,汪丽霞,等.RP-HPLC法快速测定常山胡柚果皮中3种主要成分[J].化学工程师,2024,38(11):34-38.