脊髓损伤是一种对脊髓结构和功能造成暂时或永久性严重损伤的疾病[1]，流行病学调查显示，在美国每年每百万人中约有54例脊髓损伤病例[2]，且年轻人发病率较高[3]。脊髓损伤后果较为严重，通常会导致损伤部位以下的运动和感觉功能部分或完全丧失，包括慢性疼痛、瘫痪和自主神经功能紊乱等，并引发泌尿系统感染、压疮和呼吸疾病等二次并发症[4]。目前，脊髓损伤患者的治疗方法有限，主要集中在症状管理和预防二次并发症，然而其治疗成本较高、治愈率低。因此，脊髓损伤的预防和治疗是一个具有挑战性的全球性医学和社会问题。

铁死亡是一种调节性细胞死亡（regulated cell death,RCD）模式，在形态、生物化学和遗传学上有别于其他形式的细胞死亡，具有铁过载、线粒体功能障碍及脂质过氧化的显著特征[5]。研究表明，铁死亡在脊髓损伤中起到关键作用，受损部位会出现铁过量积累和脂质过氧化现象，进而加剧神经细胞损伤和神经功能障碍，并且铁死亡在脊髓损伤的急性期和慢性期均可见，与炎症反应和氧化应激密切相关[6]。

在中医学中，脊髓损伤属于“痿证”“体惰”范畴，病因多为因久卧伤气，致使气虚无力推动血行，进而筋骨痿软，故在临床治疗中强调益气活血为主[7]。黄芪有“补药之长”之称，具有补气升阳、托毒生肌、消肿活血等功效[8]。黄芪甲苷作为黄芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗细胞凋亡与抗炎等特性，能够有效减轻神经损伤[9-10]。外泌体是一类由细胞分泌的外囊泡，能够携带蛋白质、脂质、RNA等多种生物活性分子，能够通过与靶细胞的融合或内吞作用传递信息进而影响靶细胞的功能。近年来研究发现，骨髓间充质干细胞外泌体（bone marrow mesenchymal stem cell exosomes,BMSCs-Exos）在治疗脊髓损伤方面，具有显著的效果[11]，并且BMSCs-Exos可以通过抗氧化应激、调节铁稳态等多种机制调节铁死亡，从而保护细胞和促进组织修复[12]。

PC12细胞是一种源自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，尽管其并非脊髓神经元，但在神经生物学研究中广泛应用，尤其在体外实验中常使用H₂O₂处理PC12细胞来模拟氧化应激引发的神经细胞损伤模型[13]。虽然H₂O₂诱导的氧化应激并不具备脊髓损伤的特异性，但它能够有效地模拟脊髓损伤中的氧化应激和铁死亡过程。因此，本研究旨在通过使用PC12细胞模型，探讨黄芪甲苷联合BMSCs-Exos在抑制铁死亡和减轻氧化应激损伤方面的协同作用。本研究为脊髓损伤的治疗提供了新的思路，也为包括脊髓损伤在内的其他神经损伤和疾病的治疗开辟新的途径。

1、材料

1.1细胞株与动物

大鼠PC12细胞（批号20230203）由上海赛佰慷生物科技有限公司提供。

SPF级SD大鼠8只，4周龄，雌雄各半，体质量（100±10)g，用于提取BMSCs。动物购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SYXK（湘）2021-0074），饲养于湖南中医药大学动物实验中心，本实验研究符合湖南中医药大学实验动物伦理委员会规定（伦理号ZYFY20221111-44）。

1.2药品与试剂

磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline,PBS，批号WHB823U281）购自武汉普诺赛公司；4%组织细胞固定液（paraformaldehyde,PFA，批号14F20230219）、青霉素/链霉素（批号09C230219）、DMEM培养基（批号01A230516）、多聚甲醛-戊二醛混合固定液（批号15C20220621）、茜素红染色液（批号O7R20230101）、阿利新蓝染色液（批号06W20230209）、成脂油红O染色液（批号15B20230524）、GPX4抗体（批号12F20221205）、FTH1抗体（批号1DW20230125）、FPN抗体（批号8GR20220430）、GAPDH抗体（批号05KT20220901）、HRP标记的山羊抗小鼠二抗（批号O1W0221107）、HRP标记的山羊抗兔二抗（批号05C20221211）均购自长沙Abiowell生物科技有限公司；胎牛血清（批号23EG100816）购自香港Evacell公司；TRIzol试剂（批号03877）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；环氧树脂（批号T24459）购自上海源叶生物科技有限公司。RT-q PCR逆转录试剂盒（批号601924117020）、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA，批号080823240313）、线粒体膜电位检测试剂盒JC-1（批号092723240116）均购自上海碧云天生物技术有限公司。黄芪甲苷（质量分数≥98.0%，批号9VX21580001）、脂质染料PKH26(lipophilic dye PKH26,PKH26）试剂盒（批号410E513876）、3%磷钨酸钠（批号88GD0362247）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI，批号0631GFX0518）均购自美国Sigma公司。Fer-1（批号A437141337769）购自上海Med Chem Express公司。MDA含量检测试剂盒（批号WE08J9R23719）、GSH检测试剂盒（批号WE1125K1505）、Fe2+检测试剂盒（批号WE23RT015618）和GPX4检测试剂盒（批号WE23RS02UL24）、白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号WE315U51478）、IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒（批号WE0045RF1378）、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号WE14VB772105）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；分化簇9抗原（cluster of differentiation 9,CD9）抗体（批号GR3356785-3）、CD29抗体（批号GR3356854-2）、CD90抗体（批号GR3356796-2）、CD44抗体（批号GR3356552-1）、CD34抗体（批号GR3356782-4）、CD45（批号GR3356788-2）、CD63抗体（批号GR3356331-2）、肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101）抗体（批号GR4322566-2）、钙连蛋白（calnexin）抗体（批号GR5567855-3）均购自英国Abcam公司；acodylate缓冲液（批号0215001158）购自美国Poly Scientific R&D公司。

1.3仪器

XE-100型超高速离心机（美国Beckman公司）；FACSymphonyTM型流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）；Nanosight LM10型系统（美国Nanosight Ltd公司）；H7650型透射电镜（日本日立公司）；Olympus FV3000型共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司）；FLX800型多功能荧光成像仪（美国Bio Tek公司）；1681130B型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

2、方法

2.1 BMSCs的分离、培养及鉴定

采用文献方法[14]获取原代大鼠BMSCs，将大鼠脱颈处死后，放入75%乙醇中浸泡10 min，将大鼠置于超净工作台上，使用生理盐水在无菌的条件下冲洗股骨和胫骨骨髓腔，收集骨髓细胞悬液并对悬液进行充分吹打，稀释至40 m L的培养基中，然后将骨髓细胞悬液接种到DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）的培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，3 d后换液，第3代细胞用于实验。采用流式细胞术检测BMSCs表面阳性标志物CD29、CD90、CD44和阴性标志物CD45、CD34。于电子显微镜下观察BMSCs，进行形态学鉴定；采用茜素红染色、油红O染色和阿利新蓝染色评价成骨、成脂和软骨分化能力，用于BMSCs鉴定。

2.2 BMSCs-Exos的分离及鉴定

根据文献方法[15]，首先收集细胞培养上清液，进行低速离心去除死细胞和较大的细胞碎片，经0.22μm滤膜去除更小的细胞碎片。然后将滤过后的上清液4℃、110 000×g超速离心75 min，小心弃去上清液，保留沉淀物。将沉淀物用PBS重悬，再次4℃、110 000×g超速离心75 min，弃去上清液，将沉淀物（即外泌体）重悬于适量的PBS中，于-80℃保存备用。采用透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）观察外泌体的形态；采用纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体的粒径分布和浓度；Western blotting检测外泌体标志蛋白CD63、CD9和TSG101以及calnexin的表达，旨在确认外泌体的存在、评估其纯度。

2.3 PC12细胞对外泌体的摄取检测

根据PKH26试剂盒说明书进行外泌体细胞摄取实验。使用无血清培养基将外泌体重悬，并用PKH26染料在室温下孵育5 min，加入等体积的PBS终止反应。4℃、110 000×g超速离心60 min去除未结合的染料，并将清洗后的外泌体重悬于PBS中。将PC12细胞培养至生长密度70%～80%，用无血清培养基清洗2次后，将PKH26标记的外泌体加入细胞培养基中培养24 h[16]，细胞用4%的PFA固定30 min后，使用DAPI染色固定10 min，采用共聚焦显微镜观察外泌体在细胞中的分布和摄取情况。

2.4细胞分组及给药

根据文献方法构建PC12细胞模拟体内脊髓损伤模型[17-18]，将H2O2(200μmol/L）添加至DMEM培养基中，处理PC12细胞24 h。使用铁死亡抑制剂Fer-1(1μmol/L）处理24 h用于构建阳性对照组[19]。根据本课题组前期实验及文献方法[20-21]，将细胞分为对照组、模型组、Fer-1(1μmol/L）组、黄芪甲苷（0.1μmol/L）组、BMSCs-Exos(100μg/m L）组、黄芪甲苷（0.1μmol/L)+BMSCs-Exos(100μg/m L）组。各给药组细胞给予相应药物干预24 h，对照组、模型组细胞给予正常培养基。

2.5 ELISA法检测细胞炎症因子水平

收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子水平。

2.6流式细胞术及相关生物标志物检测细胞内ROS和氧化应激水平

取对数生长期的PC12细胞，细胞分组同“2.4”项，各组细胞分别进行药物干预处理后，使用无血清培养基清洗细胞2次，将DCFH-DA(50μmol/L）加入细胞中，37℃孵育20 min,孵育期间，每5min轻摇培养皿1次，以确保染料均匀分布和充分渗透。孵育结束后，使用PBS清洗细胞3次，去除未结合的染料，通过流式细胞仪检测细胞荧光强度。为进一步评估细胞内的氧化应激水平和铁死亡程度，根据各试剂盒说明书检测MDA、GSH、Fe2+及GPX4水平。

2.7 JC-1检测线粒体膜电位

采用JC-1检测线粒体膜电位以评估线粒体功能和细胞凋亡情况。根据试剂盒说明书进行操作。PC12细胞密度达到70%～80%时，收集细胞并加入JC-1染色工作液，轻柔吹打数次后，于细胞培养箱中培养20 min后，4℃离心，弃上清，加入1 m L JC-1染色缓冲液重悬细胞，再次4℃离心，弃上清。重复上一步骤后，用200μL的JC-1染色缓冲液重悬细胞，30 min内检测样本荧光强度。

2.8透射电子显微镜观察线粒体形态

将PC12细胞在含有2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1 mol/L cacodylate缓冲液中固定1～2 h，随后用0.1 mol/L cacodylate缓冲液多次清洗细胞，再将细胞固定于1%锇酸中1 h。分别采用30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液脱水10 min。用Epon 812环氧树脂对细胞进行预包埋，切片后用2%的醋酸铀和0.2%的柠檬酸铅染色，于透射电子显微镜下观察线粒体形态。

2.9 RT-q PCR检测相关基因表达

参照RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，进行PCR扩增定量，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法比较分析各基因表达。基因引物根据在NCBI上搜索目的基因的序列，运用Primer 5软件设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成引物，具体引物序列见表1。

表1 引物序列

2.10 Western blotting检测铁死亡相关蛋白表达

采用RIPA裂解液在冰上裂解细胞，提取各组细胞总蛋白，采用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，采用5%的脱脂牛奶进行封闭，一抗4℃孵育过夜，PBST洗涤3次。在室温下二抗孵育1.5 h,PBST洗涤3次，采用ECL显色曝光，利用Image-J软件定量分析。

2.11统计学分析

采用Graph Pad 8.0软件进行统计学分析，所有数据用表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey’s检验。

3、结果

3.1 BMSCs的鉴定

流式细胞术检测BMSCs表面标记物结果显示，CD29、CD90、CD44呈阳性高表达，而CD45、CD34不表达（图1-A）；通过电子显微镜下观察，镜下细胞展现了BMSCs的典型特征，呈纺锤形和星形细胞形态、以单层排列贴壁生长，具有结构清晰的细胞质和细胞核（图1-B);BMSCs在成骨、成脂和成软骨诱导培养基中培养后，茜素红染色、油红O染色和阿利新蓝染色结果均呈阳性（图1-C）。

3.2 BMSCs-Exos鉴定

BMSCs-Exos具备典型的外泌体形态和结构特征，形态呈现圆形或椭圆形，表面光滑，边界清晰（图2-A);NTA粒径分析结果显示，BMSCsExos主要集中在92 nm处，符合典型外泌体的粒径范围[13]。次要峰值在127 nm和162 nm处，表明样品中存在一些大小略有差异的外泌体群体，而253 nm和335 nm可能为外泌体聚集或微泡（图2-B);Western blotting检测结果表明，与BMSCs组比较，BMSCs-Exos中CD9、CD63、TSG101均显著呈现高表达，但不表达Calnexin（图2-C）。以上数据表明提取的BMSCs-Exos具有较高的纯度和一致性。

图1 BMSCs鉴定结果

图2 BMSCs-Exos鉴定结果(,n=3)

3.3 PC12细胞对外泌体的摄取

通过检测PC12细胞对PKH26标记定位的BMSCs-Exos摄取情况发现，BMSCs-Exos组的红色荧光信号强烈且分布于细胞内，而PBS组未观察到红色荧光信号（图3）。

3.4黄芪甲苷联合BMSCs-Exos对炎症因子水平影响

如表2所示，与对照组比较，模型组细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著增加（P<0.05）；与模型组比较，使用BMSCs-Exos、黄芪甲苷或Fer-1处理细胞后，各组细胞炎症因子的表达显著降低（P<0.05）。与单独使用BMSCs-Exos、黄芪甲苷或Fer-1比较，黄芪甲苷与BMSCs-Exos联合处理细胞后，细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著下调（P<0.05）。

3.5黄芪甲苷联合BMSCs-Exos对脊髓损伤细胞模型PC12细胞ROS水平表达情况

如图4所示，与对照组比较，模型组细胞中ROS表达水平显著增加（P<0.05）；与模型组比较，BMSCs-Exos、黄芪甲苷与Fer-1单独处理均显著降低细胞中ROS表达（P<0.05），说明其具有显著的抗氧化作用；与单独使用BMSCs-Exos、黄芪甲苷或Fer-1比较，黄芪甲苷与BMSCs-Exos联合处理降低了细胞内ROS表达（P<0.05），表明联合使用时效果最佳。

图3 荧光失踪PC12细胞对外泌体的摄取

表2 各组细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α表达情况(,n=3)

3.6黄芪甲苷联合BMSCs-Exos对脊髓损伤细胞模型氧化应激的影响

如图5所示，与对照组比较，细胞经过H2O2处理后，MDA和Fe2+水平显著增加（P<0.05），而GSH和GPX4水平显著降低（P<0.05）；与模型组比较，BMSCs-Exos或黄芪甲苷显示了类似的效果，抑制了H2O2引起的MDA和Fe2+水平升高，恢复了GSH和GPX4水平，其效果与Fer-1处理相似（P<0.05）；与单独使用BMSCs-Exos、黄芪甲苷或Fer-1比较，黄芪甲苷联合BMSCs-Exos表现出显著的效果（P<0.05）。

3.7黄芪甲苷联合BMSCs-Exos对脊髓损伤细胞模型线粒体膜电位与线粒体形态影响

如图6所示，对照组细胞发出红色荧光，而在线粒体膜电位降低时细胞则会发出绿色荧光。与对照组比较，模型组细胞呈现出绿色荧光，表明明显降低了线粒体膜电位，提示线粒体功能受损，细胞凋亡增加；与模型组比较，黄芪甲苷、BMSCs-Exos以及Fer-1单独处理后，减轻了H2O2引起的线粒体损伤和细胞凋亡（P<0.05）；黄芪甲苷联合BMSCs-Exos处理组细胞显示出显著的红色荧光，线粒体膜电位恢复较好，表明联合处理组在减轻H2O2引起的线粒体损伤和细胞凋亡方面具有更加显著的效果（P<0.05）。

图4 流式细胞术检测各组ROS水平表达(,n=3)

图5 试剂盒检测MDA、GSH、Fe2+、GPX4水平(,n=3)

如图7所示，H2O2处理组出现线粒体皱缩、线粒体膜增厚以及线粒体嵴结构模糊或断裂等铁死亡特征的改变；BMSCs-Exos或黄芪甲苷单独处理与Fer-1处理结果相似，线粒体形态明显改善，线粒体肿胀减少，线粒体嵴结构较为清晰完整，表明在一定程度上减轻了H2O2引起的线粒体损伤；比较，模型组细胞呈现出绿色荧光，表明明显降低了线粒体膜电位，提示线粒体功能受损，细胞凋亡增加；与模型组比较，黄芪甲苷、BMSCs-Exos以及Fer-1单独处理后，减轻了H2O2引起的线粒体损伤和细胞凋亡（P<0.05）；黄芪甲苷联合BMSCs-Exos处理组细胞显示出显著的红色荧光，线粒体膜电位恢复较好，表明联合处理组在减轻H2O2引起的线粒体损伤和细胞凋亡方面具有更加显著的效果（P<0.05）。

图6 JC-1荧光染色检测线粒体膜电位(,n=3)

图7 透射电镜观察线粒体形态变化(×12 000)

如图7所示，H2O2处理组出现线粒体皱缩、线粒体膜增厚以及线粒体嵴结构模糊或断裂等铁死亡特征的改变；BMSCs-Exos或黄芪甲苷单独处理与Fer-1处理结果相似，线粒体形态明显改善，线粒体肿胀减少，线粒体嵴结构较为清晰完整，表明在一定程度上减轻了H2O2引起的线粒体损伤；黄芪甲苷联合BMSCs-Exos处理组线粒体形态恢复效果最明显，线粒体嵴结构清晰、肿胀最少及线粒体膜完整。

3.8黄芪甲苷联合BMSCs-Exos对脊髓损伤细胞模型PC12细胞GPX4、FTH1和FPN表达水平影响

如图8所示，与对照组比较，模型组细胞GPX4、FTH1和FPN的m RNA表达显著降低（P<0.05），与模型组比较，Fer-1、黄芪甲苷和BMSCs-Exos单独处理均能显著上调GPX4、FTH1和FPN的m RNA表达（P<0.05），黄芪甲苷联合BMSCs-Exos组与BMSCs-Exos组相比，对GPX4、FTH1和FPN的m RNA表达进一步上调（P<0.05）。

如图9所示，Western blotting检测铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1和FPN的表达结果表明，H2O2引起PC12细胞中GPX4、FTH1和FPN的表达降低，而Fer-1、黄芪甲苷和BMSCs-Exos单独处理或联合处理均能显著恢复这些蛋白的表达，且联合处理效果最佳（P<0.05）。以上结果表明，黄芪甲苷联合BMSCs-Exos处理在H2O2引起的PC12细胞铁死亡中具有显著的保护作用，通过减少ROS水平、恢复线粒体膜电位、改善线粒体形态以及恢复铁死亡相关蛋白的表达，显著抑制了铁死亡过程。

图8 q RT-PCR检测GPX4、FTH1和FPN m RNA的表达情况(,n=3)

图9 Western blotting检测铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1和FPN的表达(,n=3)

4、讨论

脊髓损伤可分为原发性和继发性损伤，其中原发性损伤多由物理损伤导致的骨折或脱位，造成受伤局部血肿、缺血、电解质紊乱或血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier,BSCB）被破坏，这些变化引发ROS的产生和释放，造成局部组织氧化损伤以及神经元和神经细胞凋亡和坏死，从而推动继发性损伤发生[22]。脊髓的正常功能依赖于多种细胞类型的协同作用，其中神经元是脊髓功能实现的重要载体，神经元细胞的功能损伤和形变破裂会导致患者运动、感觉及自主神经功能障碍[23]。研究发现，脊髓损伤的发生发展与神经元细胞铁死亡密切相关[24]。脊髓损伤发生后，机体会出现多种与铁死亡相关的变化，如铁代谢障碍、磷脂过氧化增加和GSH合成中断。因此，在脊髓损伤治疗中，调控这些铁死亡相关过程至关重要。

近年来，越来越多的研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）来源的外泌体对脊髓损伤神经元铁死亡的调控具有巨大潜力[25]。与其他来源外泌体相比，MSCs源性外泌体（mesenchymal stem cellsexosomes,MSCs-Exos）具有独特优势。MSCs-Exos能够穿过BSCB抵达脊髓损伤部位，抑制炎症反应、改善BSCB和细胞抗氧化能力、参与调控铁代谢及抑制瘢痕形成和促进轴突再生，具有较高的脊髓损伤修复能力。中医将治疗脊髓损伤的核心理论归结为扶正祛邪，补益气血，通利脉络的原则[26]。黄芪甲苷作为黄芪的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化损伤、抗纤维化及调节能量代谢等药理功效[27]，能够通过调理气血、改善微循环、扶正祛邪等途径促进脊髓损伤的康复。并且，黄芪甲苷可通过调控细胞凋亡、焦亡以及坏死等多种RCD方式，发挥保护脊髓神经、减轻继发性病理损伤和促进功能恢复的作用[28-29]。

本研究聚焦于脊髓损伤过程中脊髓神经细胞继发性损伤的主要机制，即由脊髓损伤后局部组织氧化损伤产生引起的神经元细胞铁死亡，揭示了黄芪甲苷联合BMSCs-Exos对脊髓损伤后继发性损伤中细胞铁死亡的影响。结果证实，BMSCs来源丰富易获取，BMSCs-Exos可以被PC12细胞摄取，可以作为干细胞外泌体治疗脊髓损伤的理想细胞；H2O2成功诱导PC12细胞，建立了氧化应激损伤模型，显著增加了ROS的表达水平，促进了炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，而黄芪甲苷或BMSCs-Exos单独处理后能够明显降低ROS的表达、降低IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子的释放，表明黄芪甲苷和BMSCs-Exos均能起到抵抗氧化应激损伤，发挥抗炎的作用，其中黄芪甲苷联合BMSCs-Exos使用效果更佳。线粒体的形态及膜电位变化可以有效地作为细胞存活状态的评估指标，当细胞发生铁死亡时，线粒体在形态上相较于正常细胞线粒体体积显著缩小、嵴结构减少、膜密度增加，甚至可能出现外膜破裂现象，与此同时线粒体膜电位显著下降，这通常与ROS的过度生成和脂质过氧化有关[25]。本研究发现，细胞经H2O2处理后出现线粒体皱缩、线粒体膜增厚以及线粒体嵴结构模糊或断裂等铁死亡特征的改变，并且明显降低了线粒体膜电位，经过黄芪甲苷或BMSCs-Exos单独处理后，线粒体形态得到明显改善，线粒体膜电位增加，而联合处理组效果更加明显，表明黄芪甲苷联合BMSCs-Exos处理能够有效保护线粒体功能，减轻氧化应激和铁死亡对细胞的损伤。铁死亡的发生从本质上是由氧化系统（如Fe2+和ROS）与抗氧化系统（如GPX4和GSH）之间的平衡决定的，在正常生理条件下，这两种系统在细胞内保持动态平衡，从而维持正常的细胞功能。并且，FTH1和FPN在细胞铁死亡中起到关键的调节作用，FTH1通过储存铁离子来减少游离铁的毒性，而FPN则通过将铁离子排出细胞来维持铁稳态[30-31]。MDA是脂质过氧化的产物，其水平升高是铁死亡的标志，反映了细胞内脂质过氧化程度和氧化应激状态的严重性[31]。本次研究表明，细胞经过H2O2处理，降低了GSH、GPX4和FTH1表达，增加了MDA、Fe2+和FPN的表达，黄芪甲苷或BMSCs-Exos单独处理后有效抑制了这些变化，而黄芪甲苷联合BMSCs-Exos处理后进一步有效地恢复抗氧化系统的功能，降低脂质过氧化产物的水平，减少Fe2+的积累，从而抑制细胞铁死亡过程。

综上，本研究阐明了黄芪甲苷联合BMSCs-Exos能够有效改善氧化应激引起的细胞线粒体损伤，显著抑制细胞铁死亡，并且可能对其他涉及氧化应激和铁死亡机制的神经疾病和损伤中发挥神经保护作用。

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基金资助:湖南省自然科学基金面上项目(2023JJ30472); 湖南省教育厅重点课题(22A0261); 湖南省卫生健康委科研项目(B202304078103);湖南省中医药管理局课题(B2023028);

文章来源:刘恩旭,聂颖,段嘉豪,等.黄芪甲苷联合BMSCs-Exos对PC12细胞铁死亡的影响[J].中草药,2024,55(23):8056-8066.