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20种常见中药对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的体外抑菌活性

2020-05-20 1075 上传者：管理员

摘要：目的:考察20种常见清热解毒中药对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)的体外抑菌活性,并探索临床治疗CRAB感染的新途径。方法:采用微量肉汤稀释法筛选出CRAB菌株,再将20种中药用煮沸法制备成中药溶液,并通过微量肉汤稀释法测定中药的最小抑菌浓度(MIC),最后计算出具有明显体外抑菌作用的中药的MIC50及MIC90。结果:20种中药中夏枯草、黄芩、半枝莲、黄连有较好的抑菌效果,4种中药的MIC范围分别为3.13～25.0、1.56～12.5、3.13～50.0、3.13～25.0g/L;MIC50分别为6.25、3.13、6.25、6.25g/L,MIC90分别为12.5、6.25、25.0、12.5g/L。结论:20种中药中4种中药对CRAB有明显的抑制作用,其中黄芩的抑菌效果最佳。

关键词：
中药
体外实验
抑菌作用
碳青霉烯耐药
鲍曼不动杆菌
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鲍曼不动杆菌是院内感染中分离率最高的非发酵革兰阴性杆菌,可以引起呼吸科、重症监护室(ICU)、神经外科等免疫力低下住院患者的呼吸系统感染、尿路感染、脑膜炎等多种感染[1]。碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南和帕尼培南)一直是临床上治疗该类细菌感染的重要药物;然而近年来,碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌(CRAB)检出率逐年升高,并且有暴发流行的趋势,给临床治疗带来极大挑战;寻找替代抗生素治疗CRAB感染的新药物已迫在眉睫[2-3]。大量研究表明,中药对感染性疾病的治疗有独特的作用,且具有不易产生耐药性、毒副作用小等特点[4]。本研究考察了菊花、黄芩、黄连、金银花等20种清热解毒中药对CRAB的体外抑菌活性,预期筛选出有明显体外抑菌效果的中药,为临床该类细菌感染的治疗和中药的推广应用提供实验依据。

1、材料与方法

1.1药物与试剂

黄连、黄芩、夏枯草、半枝莲、金银花、射干、蒲公英、白花蛇舌草、板蓝根、鱼腥草、决明子、知母、栀子、大叶青、赤芍、牡丹皮、芦根、菊花、生地黄、石膏等均购买于佛山市第一人民医院药剂科,采用煮沸法制备溶液。上述20味中药各取30g,分别用500mL蒸馏水浸泡约1h后,在砂锅中文火煎煮2h,用无菌纱布趁热过滤煎液,再加入300mL蒸馏水于滤渣中,用同样的方法煎煮2h,将两次过滤后的煎液合并至烧杯中,加热浓缩到30mL,即可得到浓度为1g/mL的中药原液,将制备好的药液装入瓶中加盖,于高压蒸汽灭菌锅中高压灭菌(121℃,15min)待冷却后保存于4℃冰箱备用。亚胺培南(大连美仑,A0401A)、美罗培南(大连美仑,D1204A),用分析天平分别称取10.24mg的亚胺培南与美罗培南并分别溶解于10mL的无菌蒸馏水中,配制成1024mg/L的药液,保存于4℃冰箱备用。培养基:青岛海博公司。

1.2菌株

36株鲍曼不动杆菌均来自广东省佛山市中医院患者的痰液、分泌物等各种标本,并由佛山市中医院检验科对细菌进行分离与鉴定。将所得鲍曼不动杆菌菌株接种于NB固体培养基,37℃孵育12～14h后取出,分别刮取若干单个菌落用NB液体培养基稀释至0.5个麦氏浊度(约为1×108CFU/mL)。

1.3CRAB菌株的筛选

采用96孔板微量肉汤稀释法。取96孔板,分别在每排的第一个孔加入已稀释至1024mg/L的亚胺培南及美罗培南药液200μL,第2至12列每孔依次加入100μLNB液体培养基,再用排枪从第1列中取100μL药液至第2列孔,混匀,依此类推至第10列,弃去100μL,从第1列至第11列每孔依次加入0.5麦氏单位用NB液体培养基稀释1000倍的菌液100μL,最后将96孔板放入培养箱37℃培养18～24h,观察读取并记录MIC,根据抗微生物药物敏感性执行标准,最小抑菌浓度(MIC)大于8mg/L为耐药(R),4～8mg/L为中介(I),小于4mg/L为敏感(S),从36株鲍曼不动杆菌中筛选出CRAB菌株。

1.4中药对CRAB菌株抑菌作用初筛试验

采用纸片扩散法。1)自制药敏纸片:用打孔器将滤纸打成直径为6mm的纸片,放入培养皿中经高压灭菌,放入烘箱烘干,再将纸片浸泡在中药药液中,当纸片吸收药液至饱和后,将其放置在无菌操作台中晾干。2)纸片扩散法:取350μL0.5麦氏浊度的CRAB菌株菌液接种于NB固体培养基上并涂布均匀,将药敏纸片分散贴于培养基表面,37℃培养18～24h,测量并记录抑菌圈直径。依据中药药理研究方法学,纸片扩散法判别标准:抑菌圈直径大于16mm为高度敏感,10～15mm中度敏感,10mm以下为没有抑制活性或耐药[5],初步筛选出对CRAB菌株有抑菌作用的中药。

1.5初筛后中药对CRAB菌株MIC的测定

采用96孔板微量肉汤稀释法。取96孔板,分别在每排的第一个孔加入已稀释100g/L初筛后中药药液200μL,第2～12列每孔依次加入100μLNB液体培养基,再用排枪从第1列中取100μL中药药液至第2列孔,混匀,依此类推至第10列,弃去100μL,从第1列至第11列每孔依次加入0.5麦氏单位用NB液体培养基稀释1000倍的CRAB菌液100μL,将96孔板放入培养箱37℃培养18～24h,最后观察读取并记录MIC。

2、结果

2.1耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌(CRAB)的筛选结果

从本实验所收集的菌株36株鲍曼不动杆菌中筛选出33株耐药菌株,菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药率达到91.7%。见表1。

表136株鲍曼不动杆菌对美罗培南、亚胺培南的敏感性检测结果[株数(%)]

2.220种中药抑菌作用初筛结果

见表2。对CRAB有明显抑菌作用的中药有夏枯草、黄连、黄芩、半枝莲4种,其他16种中药对菌株均无体外抑菌活性。

表220种中药对33株碳青霉烯耐药菌株体外抑菌作用

2.34种抑菌作用明显中药最小抑菌浓度(MIC)测定结果

结果见表3,并计算出MIC范围、MIC50、MIC90,结果见表4。通过4种中药对CRAB菌株的MIC范围、MIC50、MIC90比较发现,黄芩的体外抑菌活性最强。

表34种中药MIC测定结果(g/L)

表44种中药对CRAB菌株的MIC范围、MIC50、MIC90测定结果(g/L)

3、讨论

鲍曼不动杆菌是院内感染的重要病原菌之一,在医院的各种环境中分布很广且生存能力很强,对危重患者和ICU中的病人威胁很大。近年来,碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南、美洛培南、帕尼培南)因其具有抗菌谱广、β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点,已经成为治疗AB及其他细菌感染最主要的抗菌药物之一。但是近年来,耐碳青霉烯抗生素菌株引发的感染病例逐年上升,且常常暴发或流行。最新数据显示不动杆菌对其耐药率已超过70%[6]。本实验从广佛地区各大医院收集的36株鲍曼不动杆菌中检测出33株耐碳青霉烯类抗生素菌株,耐药率达到91.7%。

传统中药资源丰富,毒副作用小,具有多方面药理效应,具有抑制细菌生长的功效且不易产生耐药性的特点,已成为抗感染药物的另一研究重点。黄芩、夏枯草、半枝莲、黄连、板蓝根、菊花等20种中药,具有泻火解毒、清热燥湿等功效。有研究表明黄连、黄芩的中药复方颗粒对泛耐药鲍曼不动杆菌有着不同程度的体外抑制作用;一些中药可阻断细菌某些组分的合成或抑制细菌外排泵,从而达到抑菌作用[7-8]。本实验研究对筛选出的33株CRAB进行20种中药体外抑菌活性实验,结果发现黄连、夏枯草、黄芩、半枝莲有很好的抑菌效果,MIC90分别为:12.5、12.5、6.25、25.0g/L;其中黄芩的作用效果最好。在目前临床CRAB感染患者的治疗过程中,特别是在抗生素治疗无效的情况下,本实验结果为临床提供中药抑菌的新思路,同时对黄芩、半枝莲等中国传统中药抗菌治疗的探索应用提供了实验依据。

参考文献：

[2]侯辰蕊,戎建荣,栗子洋,李霞,王瑞雪,高春艳.产NDM-1耐碳青烯酶肠杆菌科细菌筛查研究[J].中国卫生检验杂志,2015,25(23):4157-4159.

[3]兰小琴.五倍子等8种中药对多重耐药鲍曼不动杆菌体外抑菌活性的研究[J].中国卫生检验杂志,2017,27(21):3086-3088.

[4]房杰,孙兰菊,陈明慧,等.清热解毒方对耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的抑菌作用[J].中国中西医结合外科杂志,2018,24(1):74-78.

[5]彭苑霞,刘晓强,温羚玲,等.大黄等5味中药及单体成分对临床多重耐药菌的抑制作用[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(22):103-107.

[7]张辉,张小江,徐英春,等.2005-2014年CHINET不动杆菌属细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2016,16(4):429-436.

陈深元,曾敏敏,杨烨健,杨安平,龚道元,刘爱平,甘春葆,陈鑫.20种中药对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的体外抑菌作用[J].中国中医药科技,2020,27(03):370-372.