慢性肾脏病是一个严重的公共健康问题，其发病率逐年增高，且有年轻化的趋势[1]。CKD常伴有多种代谢性紊乱，其中将近50%的患者会出现营养不良，导致蛋白质能量消耗，主要表现为肌肉萎缩、体质量下降、血清白蛋白水平降低等，这不仅影响了患者的生存质量、降低了其治疗耐受性，而且还是造成CKD患者死亡的主要诱因之一[2]。中医学认为，CKD归属“水肿”“慢肾风”“尿血”“腰痛”等范畴，病机主要与脾、肾、肺有关[3]。有研究认为，CKD以脾、肾亏虚为主，脾虚导致阳气不升、谷气下流，因此CKD的中医治疗多以健脾为主[4]。

四君子汤是益气健脾的代表方剂，出自《太平惠民和剂局方》，由人参、茯苓、白术和甘草4味中药组成。本课题组前期将四君子汤应用于脾肾两虚型CKD患者的治疗，发现其可明显改善CKD患者PEW状态[5]，但是其作用机制尚未阐明。近年来的研究发现，Rho相关蛋白激酶1(ROCK1）/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）/蛋白激酶B(Akt）信号通路具有调节CKD-PEW模型骨骼肌发育与蛋白质代谢的能力，其主要组成蛋白ROCK1、PTEN、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）及Akt的活性变化对CKD-PEW疾病进展具有重要影响，是CKD患者PEW状态的潜在干预靶点[6,7]。鉴于此，本课题组拟通过研究四君子汤对CKD-PEW模型小鼠骨骼肌ROCK1/PTEN/Akt信号通路及其下游蛋白的影响，探讨其改善CKD相关PEW的可能作用机制，为四君子汤用于CKD-PEW患者的治疗提供参考。

1、材料

1.1仪器

Triathler型液体闪烁及发光测定仪（京乐自然基因生命科学有限公司）；Ti-S型荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；7500型实时荧光定量-聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI公司）；Mini-SubCellGTCell型电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2药品与试剂

四君子汤（由辽宁中医药大学附属医院药剂科提供，批号：201801014，规格：每1mL含生药量为0.5g）；复方α-酮酸片（北京费森尤斯卡比医药有限公司，批号：U1430，规格：0.63g/片）；酪蛋白（广东捷倍斯生物科技公司，批号：201803214);Masson染色试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司，批号：20190623);B淋巴细胞瘤2(Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3(Caspase-3）、β-肌动蛋白（β-actin）引物购于上海生工生物技术有限公司；HiFiScriptcDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBRMix（北京康为世纪生物技术有限公司，批号：201712135-01、201801012-03）；兔源肌萎缩蛋白Fbox-1(Atrogin-1）、肌环指蛋白1(MuRF-1）、ROCK1、PTEN、磷酸化PTEN(p-PTEN）、PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt）、β-actin抗体（美国CST公司，批号：CST4041T、CST6367T、CST4035T、CST9188S、CST9551S、CST4249S、CST582-95S、CST9614S、CST4970S）；总蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（北京碧云天生物技术有限公司，批号：121017200621、0106201700628）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：2018001005）；酪氨酸标准品（美国Sigma公司，批号：209-113-1，纯度：99%);14+C-苯丙氨酸（中国原子能科学研究院）；其他试剂均为国产分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

1.3动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠80只，6～8周龄，体质量18～20g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002]。小鼠饲养于辽宁中医药大学实验动物中心实验室[恒温（22±4）℃、恒湿（60±5）%、明暗时间各12h]，自由饮食。本研究实验方案得到了辽宁中医药大学实验动物福利伦理委员会批准。

2、方法

2.1造模

采用切除5/6肾联合低蛋白饮食法建立CKD-PEW模型。利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后，将其背部左侧毛发剃除，用碘伏进行消毒处理。用干净纱布将剃毛处四周遮住，露出手术区域，并用剪刀剪开一个小口，逐层剥离，暴露肾脏，挤出左侧肾脏并剥离肾脏两极组织，分离肾蒂周围及结缔组织，完全游离左肾；从上至肾门约0.4cm、下至肾门约0.4cm预置缝合线，勒紧缝合线并切除两极肾脏组织；7d后暴露右侧肾脏，止血钳夹紧肾门处并紧靠血管夹下方放置缝合线，在血管夹上方切除肾脏，缝合并消毒手术切口，以复制CKD模型。假手术组小鼠同期进行手术，仅剥离肾包膜，不切除肾组织。术后，用棉签压迫法止血，缝合伤口并涂上碘伏消毒，将小鼠放入鼠笼饲养。手术1周后对CKD造模小鼠分别给予4%酪蛋白饮食饲养至实验结束，以建立CKD-PEW模型；假手术组给予正常饮食。通过比较各组小鼠体质量、肌酐、尿素氮、白蛋白及24h尿蛋白水平判断模型制备是否成功[8]。

2.2分组与给药

将80只小鼠分为假手术组（n=10）和造模组（n=70），分别按照“2.1”项下方法进行假手术或者CKD-PEW造模。将造模成功的50只小鼠随机分为模型组，四君子汤低、中、高剂量组[2.34、4.68、9.36g/（kg·d），以生药量计；根据成人（60kg）临床等效剂量的1、2、4倍换算]和复方α-酮酸片组[阳性对照，1g/（kg·d）；根据成人（60kg）临床等效剂量换算]，每组10只。小鼠灌胃给药，每天给药1次，连续给药14d；假手术组和模型组小鼠同法灌胃等体积生理盐水。

2.3样本采集及处理

在末次给药1h后，称定小鼠体质量；然后利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后，剪开小鼠皮肤，迅速分离出完整的左侧胫骨前肌（Tibialisanterior,TA），称量并记录TA湿质量。将一半TA样本量（n=5）用4%多聚甲醛固定，用于测量TA横截面积。另一半TA样本量（n=5）取部分新鲜组织立即用于蛋白合成和分解代谢检测；剩余组织置于-80℃冰箱中保存，用于凋亡相关基因mRNA表达和Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信号通路相关蛋白表达的检测。

2.4TA横截面积测定

取出4%多聚甲醛固定的TA，流水冲洗数小时后，分别经70%、80%、90%、100%乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明15min，再放入石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别浸蜡60min，并进行连续切片（5μm）。切片脱蜡水化，Weigert铁苏木素染色液染色5～10min，酸性乙醇分化5～15s，流水洗3min;Masson蓝化液返蓝3～5min，流水洗3min；水洗1min，丽春红酸性品红染色液染色5～10min；弱酸工作液洗1min，磷钼酸溶液洗1～2min，弱酸工作液洗1min，放入苯胺蓝染色液中染色1～2min；弱酸工作液洗1min,95%乙醇快速脱水，无水乙醇分别脱水10s×3次，二甲苯透明5min×3次，中性树胶封片。将切片置于倒置显微镜下观察，并利用Imageproplus6.0软件计算TA横截面积。

2.5TA蛋白合成代谢能力检测

将新鲜的TA置于DMEM培养基（5mL）中，37℃下充氧孵育30min，然后在含放射性同位素14+C-苯丙氨酸的DMEM培养基中继续孵育1h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗5min×3次，随后制备50%TA匀浆液，加入10%三氨乙酸（TCA）沉淀蛋白质；吸弃上清，加入0.5mol/LNaOH溶液溶解沉淀的蛋白。取1.8mL该蛋白溶液加入闪烁液进行液闪计数，取0.2mL该蛋白溶液利用BCA试剂盒进行蛋白浓度检测，检测单位时间内（1h）掺入的14+C-苯丙氨酸的放射性含量，分析蛋白合成代谢能力[8]。

2.6TA蛋白分解代谢能力检测

将新鲜的TA置于KRB缓冲液中，37℃下充氧孵育2h，取该孵育液用10%TCA沉淀，取上清0.5mL与1.0mL5%TCA混合均匀，依次加入0.75mL硝酸、0.75mL一氧化二氮，混合均匀，55℃下孵育30min；随后加入2mL双氯乙烯萃取，吸取上清液200μL至96孔板中，利用酶标仪在450nm波长处读取吸光度值，根据前期绘制的标准曲线[以不同浓度（0～1nmol/L）酪氨酸为横坐标、吸光度值为纵坐标]，计算TA蛋白分解代谢能力[8]。

2.7TA中凋亡相关基因mRNA表达检测

采用实时荧光定量-PCR法检测TA中Bax、Bcl-2、Caspase-3mRNA表达水平。采用Trizol法提取小鼠TA中总RNA，根据逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，然后以cDNA为模板采用两步法进行PCR扩增。反应体系（共20μL):cDNA2μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL,2×TopGreenqPCRSuperMix10μL,ddH2O7.2μL。反应条件：95℃预变性5min;95℃变性10s,55℃退火30s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法测定目的基因mRNA的表达水平（式中Ct表示目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数），并计算Bax、Bcl-2mRNA表达水平的比值（Bax/Bcl-2）。引物序列及扩增产物长度见表1。

2.8TA中Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信号通路相关蛋白表达的检测

采用Westernblotting法进行检测。利用总蛋白提取试剂盒提取小鼠TA中总蛋白，根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液，进行蛋白变性，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳（100V、1.5h），湿法转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（250mA、90min);TBST缓冲液洗膜5min×3次，5%脱脂牛奶封闭1h；分别加入Atrogin-1、MuRF-1、ROCK1、PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt及β-actin一抗（稀释度均为1∶1000),4℃孵育过夜；次日，TBST缓冲液洗膜5min×3次，加入二抗（稀释度为1∶1000），室温孵育1h；经ECL化学发光显色后，使用凝胶成像系统采集图像。采用ImageJ1.8.0软件对图像光密度进行分析，以目的蛋白条带与内参β-actin条带的光密度比值表示目的蛋白的相对表达水平，以p-PTEN/PTEN、p-Akt/Akt的光密度比值表示PTEN、Akt蛋白的磷酸化水平。

表1引物序列及扩增产物长度

2.9统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计分析。试验数据均以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1小鼠体质量和TA湿质量测定结果

与假手术组比较，模型组小鼠体质量、TA湿质量显著降低（P<0.05）；与模型组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠体质量、TA湿质量均显著升高（P<0.05），且均显著高于四君子汤低剂量组（P<0.05）；四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组之间小鼠体质量、TA湿质量差异无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠体质量、TA湿质量测定结果见表2。

3.2小鼠TA横截面积测定结果

与假手术组比较，模型组小鼠TA明显萎缩，肌纤维变细，横截面积显著减小（P<0.05）；与模型组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA肌纤维变粗，横截面积显著增大（P<0.05），且四君子汤高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA横截面积显著大于四君子汤低剂量组（P<0.05）；四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组之间小鼠TA横截面积差异无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠的TA横截面显微图见图1，横截面积测定结果见表3。

表2各组小鼠体质量、TA湿质量测定结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与四君子汤低剂量组比较，ΔP<0.05

图1各组小鼠TA横截面显微图（×200)

3.3小鼠TA蛋白合成与分解代谢能力测定结果

与假手术组比较，模型组小鼠TA单位时间内蛋白质合成代谢能力显著减弱、分解代谢能力显著增强（P<0.05）；与模型组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA单位时间内蛋白质合成代谢能力显著增强、分解代谢显著减弱（P<0.05）；与四君子汤低剂量组比较，四君子汤高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠单位时间内蛋白质合成代谢能力显著增强、分解代谢显著减弱（P<0.05）；四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组之间小鼠TA单位时间内蛋白合成与分解代谢能力差异均无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠单位时间内蛋白合成与分解代谢能力测定结果见表4。

表3各组小鼠TA横截面积测定结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与四君子汤低剂量组比较，ΔP<0.05

表4各组小鼠单位时间内TA蛋白合成与分解代谢能力测定结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与四君子汤低剂量组比较，ΔP<0.05

3.4小鼠TA中凋亡相关基因mRNA表达水平测定结果

与假手术组比较，模型组小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3mRNA表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3mRNA表达水平显著降低（P<0.05）；与四君子汤低剂量组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3mRNA表达水平显著降低（P<0.05）；四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组之间小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3mRNA表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3mRNA表达水平测定结果见表5。

3.5小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平测定结果

与假手术组比较，模型组小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与四君子汤低剂量组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸组之间小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达电泳图见图2，蛋白表达水平测定结果见表6。

表5各组小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3mRNA表达水平测定结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与四君子汤低剂量组比较，ΔP<0.05

图2各组小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达电泳图

表6各组小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平测定结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与四君子汤低剂量组比较，ΔP<0.05

3.6小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信号通路相关蛋白表达水平测定结果

与假手术组比较，模型组小鼠TA中ROCK1蛋白表达水平、p-PTEN/PTEN比值显著升高（P<0.05),PI3K蛋白表达水平、p-Akt/Akt比值显著降低（P<0.05）；与模型组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA中ROCK1蛋白表达水平、p-PTEN/PTEN比值显著降低（P<0.05),PI3K蛋白表达水平、p-Akt/Akt比值显著升高（P<0.05）；与四君子汤低剂量组比较，四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组小鼠TA中ROCK1蛋白表达水平、p-PTEN/PTEN比值显著降低（P<0.05),PI3K蛋白表达水平、p-Akt/Akt比值显著升高（P<0.05）；四君子汤中、高剂量组和复方α-酮酸片组之间小鼠TA中上述指标差异均无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信号通路相关蛋白表达电泳图见图3，蛋白表达水平测定结果见表7。

图3各组小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信号通路相关蛋白表达电泳图

表7各组小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信号通路相关蛋白表达水平测定结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与四君子汤低剂量组比较，ΔP<0.05

4、讨论

肌肉萎缩是伴随着CKD的治疗同步发生的一种并发症。有研究表明，超过半数的血液透析CKD患者存在PEW状态[9]。而肌肉萎缩是CKD患者PEW的主要表现形式，也可作为预测CKD患者预后的重要指标之一。CKD-PEW患者大多会缺乏必需氨基酸，复方α-酮酸片不仅可以直接补充必需氨基酸，并且可与体内的氨基结合生成必需氨基酸，使体内蛋白质合成代谢增加，改善营养状况[10]，故本研究选用复方α-酮酸片作为阳性对照药。四君子汤具有补气、益气健脾之功效，杜红莲等[11]的研究结果证实了四君子汤能够改善脾肾两虚型CKD患者的肾功能。为了探讨四君子汤对CKD患者PEW的作用，本课题组通过5/6肾切除法构建CKD小鼠模型，同时根据CKD患者PEW的临床特点，给予4%酪蛋白饮食建立了CKD-PEW小鼠模型[12]。结果显示，四君子汤给药14d后，CKD-PEW模型小鼠体质量和TA湿质量减轻、TA横截面积减小的情况有不同程度改善，且四君子汤还能够升高模型小鼠TA蛋白合成代谢、降低其蛋白分解代谢，这说明四君子汤对CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎缩具有一定的缓解作用。

CKD-PEW引起的代谢性酸中毒、胰岛素抵抗、炎症反应、血管紧张素Ⅱ分泌增多等因素均可激活Caspase-3及泛素蛋白酶体系统，导致肌肉萎缩[13]。有研究表明，在CKD-PEW模型大鼠中骨骼肌严重萎缩，同时肌纤维中促凋亡基因Bax、Caspase-3表达上调，而抗凋亡基因Bcl-2表达显著下调，说明线粒体凋亡途径在骨骼肌蛋白能量消耗过程中具有重要作用[14]。本研究结果显示，给予四君子汤治疗14d后，CKD-PEW模型小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3mRNA表达水平显著降低，说明四君子汤可抑制骨骼肌细胞凋亡，从而缓解肌肉萎缩。在CKD中，P13K/Akt信号通路受损是引起骨骼肌蛋白质丢失的主要原因。该信号通路受损后继发UPS激活，继而引起Atrogin-1和MuRF-1的表达升高，这是骨骼肌萎缩的经典机制[15,16]。因此，骨骼肌组织中的Atrogin-1和MuRF-1的表达量可作为衡量肌肉蛋白质分解代谢情况的生物学标志[17]。本研究结果显示，四君子汤治疗14d后，CKD-PEW模型小鼠TA中Atrogin-1和MuRF-1的蛋白表达水平均显著降低，说明四君子汤可通过抑制UPS的激活来减轻CKD-PEW小鼠的骨骼肌萎缩。

Caspase-3也是参与蛋白降解的蛋白酶，可切割肌球蛋白和肌原纤维蛋白，并切割特定的19S蛋白酶体亚基，加速26S蛋白酶体的降解，而且Caspase-3能够切除ROCK1的C端半胱氨酸结构域而使其活化[18]。活化的ROCK1能够增强PTEN磷酸化，而活化的PTEN又可抑制PI3K/Akt的活性，从而促进蛋白降解，引起肌肉萎缩[19]。有研究发现，敲低ROCK1水平可抑制PTEN活性，从而负调控PI3K与p-Akt蛋白的表达，并通过下调Atrogin-1和MuRF-1表达来调控肌肉蛋白质代谢[20]。另有研究运用ROCK1的抑制剂法舒地尔干预CKD模型小鼠后发现，法舒地尔可使CKD模型小鼠的肌肉质量显著提升、体质量显著增长，故推测其是通过抑制ROCK1来降低PTEN活性、激活Akt来降低Atrogin-1和MuRF-1表达，从而抑制蛋白质分解代谢、延缓肌肉萎缩[21]。可见，ROCK1/PTEN/Akt途径在骨骼肌萎缩的发生发展中具有重要意义。本研究发现，四君子汤治疗14d后，CKD-PEW模型小鼠TA中ROCK1、p-PTEN蛋白表达水平显著降低，而PI3K与p-Akt蛋白表达水平显著升高，说明四君子汤也可通过调控ROCK1/PTEN/Akt信号通路，抑制Atrogin-1和MuRF-1表达，来改善CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎缩。

综上所述，四君子汤可增加CKD-PEW模型小鼠体质量，抑制骨骼肌萎缩，这可能是通过调控ROCK1/PTEN/Akt信号通路、抑制Atrogin-1和MuRF-1表达实现的。但本研究只是初步探讨了四君子汤改善CKD-PEW模型小鼠骨骼肌萎缩的作用机制，具体分子学机制仍需进一步研究。

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基金:辽宁省科学技术计划项目(No.20170540607).