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2种灭菌方式对止嗽立效丸HPLC指纹图谱和4种成分的影响

2021-12-17 98 上传者：管理员

摘要：目的考察60Co辐照灭菌、湿热灭菌对止嗽立效丸（麻黄、苦杏仁、甘草等）指纹图谱和4种成分含量的影响。方法该药物80%甲醇（含0.5%磷酸）提取液的分析采用AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）;流动相乙腈-0.1%磷酸,梯度洗脱;体积流量1.0mL/min;柱温30℃;检测波长210、250nm。采用单因素方差分析比较灭菌前后各成分含量变化,相似度评价、主成分分析、聚类分析对指纹图谱进行综合评价。结果15批样品指纹图谱中有23个共有峰,灭菌前后相似度均大于0.91。盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵在各自范围内线性关系良好（r≥0.9995）,平均加样回收率96.70%～99.78%,RSD1.12%～2.39%。湿热灭菌对盐酸麻黄碱、苦杏仁苷含量有显著影响（P<0.05）,而60Co辐照灭菌后各成分含量无明显变化。结论60Co辐照灭菌对止嗽立效丸HPLC指纹图谱和4种成分含量无明显影响。

关键词：
60Co辐照灭菌
HPLC指纹图谱
止嗽立效丸
湿热灭菌
甘草酸铵
盐酸罂粟碱
盐酸麻黄碱
苦杏仁苷
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止嗽立效丸由麻黄、苦杏仁、甘草、罂粟壳等7味中药组成，具有止嗽、定喘、祛痰作用，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册，但其质量控制方法无含量测定及特征图谱项；相关文献也大多以盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、吗啡等[1,2,3,4,5]为质控指标，未见指纹图谱及多成分含量测定的报道。中药制剂组成复杂，指纹图谱能较全面地反映出其成分的种类及数量，从整体上对其质量进行评价[6,7]。

中药常用灭菌方法有湿热灭菌和辐照灭菌[8],其中后者较常用的是60Co射线，具有操作方便、常温常压、效率高、耗时短等特点[9,10]。但辐照可能会引起部分成分发生变化[11,12],从而影响药物疗效，因此关于其安全性尚有争议[13,14],《中药辐照灭菌技术指导原则》规定，采用辐照技术对中药进行灭菌时，必须说明它对产品质量的影响[15]。

本实验建立了止嗽立效丸HPLC指纹图谱和盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵含量测定方法，比较60Co辐照灭菌、湿热灭菌对指纹图谱的影响及上述4种成分含量变化，以期客观全面地反映不同灭菌方式对该制剂所含成分的影响，为辐照灭菌工艺在其他中药制剂中的应用提供科学依据。

1、材料

Agilent1200高效液相色谱仪，配置Agilent二极管阵列检测器，购自美国Agilent公司；AB104N型电子天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司；UPHW-I-90T型优普系列超纯水系统，购自成都超纯科技有限公司。

盐酸麻黄碱(批号171241-201508)、苦杏仁苷(批号110820-201607)、盐酸罂粟碱(批号1214-9602)对照品，购自中国食品药品检定研究院；甘草酸铵(批号MUST-13093010)对照品，购自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

未灭菌、60Co辐照灭菌、湿热灭菌止嗽立效丸各5批，由山西华康药业股份有限公司提供，具体信息见表1。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

安捷伦ZORBAXSB-C18色谱柱(5μm,4.6mm×250mm);流动相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱(0～30min,8%～24%乙腈；30～40min,24%～50%乙腈；40～60min,50%～64%乙腈；60～70min,64%～96%乙腈；70～77min,96%乙腈；77～80min,96%～8%乙腈);体积流量1.0mL/min;检测波长210nm(0～24、42～77min)、250nm(24～42min);柱温30℃;进样量15μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液

精密称取盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵对照品适量，甲醇溶解，制成分别含四者934、718、544、572μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液

精密称取丸剂粉末0.50g,置于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇(含0.5%磷酸)10mL,盖塞，称定质量，超声提取30min,冷却，80%甲醇(含0.5%磷酸)补足减失的质量，滤过，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 方法学考察

2.3.1.1 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液(批号Q201711131)15μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定5次，测得单峰面积大于总峰面积10%的共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%,相对峰面积RSD均小于1.0%,相似度均大于0.99,表明仪器精密度良好。

2.3.1.2 重复性试验

取同一批丸剂(批号Q201711131),按“2.2.2”项下方法平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得单峰面积大于总峰面积10%的共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,相似度均大于0.99,表明该方法重复性良好。

2.3.1.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液(批号Q201711131),于0、4、8、12、24、48h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得单峰面积大于总峰面积10%的共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,相似度均大于0.98,表明溶液在48h内稳定性良好。

2.3.2 图谱生成

取15批丸剂，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取15μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定，将检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件，以S1为参照图谱进行数据匹配，采用平均数法生成对照指纹图谱(R),结果共标定23个共有指纹峰(图1),共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%,色谱图见图2。由此可知，与灭菌前比较，湿热灭菌后峰21、22面积明显减小，峰5几乎消失，而60Co辐照灭菌后均无明显变化。

2.3.3 相似度评价

将各批样品HPLC指纹图谱(图3)导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件进行数据匹配，采用平均数法生成对照指纹图谱，建立共有模式，计算相似度，结果见表2。

由此可知，各批样品相似度均在0.91以上，其中灭菌前、60Co辐照灭菌后相似度较高，而且比较接近，表明60Co辐照灭菌对指纹图谱影响较小；湿热灭菌相似度较低，表明在该灭菌方式下指纹图谱变化较大。

2.3.4 共有峰峰面积比值比较

参考《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[16]相关要求，经指纹图谱峰面积数据匹配后计算单峰面积占总峰面积比例。结果，单峰面积占总峰面积比例在5%～10%之间的共有峰为峰3、5、11、22,在10%～20%之间的为峰6、21。

选择稳定性好、分离效果理想的甘草酸铵(峰14)作为参照，计算灭菌前后共有指纹峰峰面积与参照物峰面积(A0)比值，以及灭菌前后共有峰峰面积比值的差值，公式为差值=[(Ax-A0)/A0]×100%,比较单峰面积占总峰面积比例≥5%共有峰的变化，结果见表3。

由此可知，60Co辐照灭菌后，峰21、22面积明显减小；湿热灭菌后，除峰3、11外，其他共有峰峰面积比值的差值均大于±25%,尤其是峰5、21、22,表明湿热灭菌对峰面积较大的共有峰(≥5%)影响更大。

2.4 成分含量测定

2.4.1 指标成分选择

参考2020年版《中国药典》一部、相关文献和标准，预实验考察了盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸铵、吗啡、盐酸罂粟碱等成分，与其指纹图谱特征峰进行保留时间和紫外扫描图谱的比对后，筛选出适合C18色谱柱分析和紫外检测，而且对照品易获得、色谱峰分离效果良好的4种成分作为指标，分别为盐酸麻黄碱(峰3)、苦杏仁苷(峰6)、盐酸罂粟碱(峰13)、甘草酸铵(峰14),色谱图见图4。

2.4.2 线性关系考察

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，80%甲醇稀释成6个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表4,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液(批号Q201711131)15μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定5次，测得盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵峰面积RSD分别为2.30%、0.78%、2.04%、0.58%,表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验

取同一批丸剂(批号Q201711131),按“2.2.2”项下方法平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵含量RSD分别为0.79%、2.26%、1.85%、0.90%,表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液(批号Q201711131),于0、2、4、8、12、24、48h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵峰面积RSD分别为2.43%、2.19%、2.66%、1.40%,表明溶液在48h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验

称取各成分含量已知的丸剂(批号Q201711131)6份，每份约0.25g,置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液1mL,按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表5。

2.4.7 样品含量测定

取15批丸剂，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量及其相对值[17],平行3份，取平均值，再采用SPSS22.0软件对其进行单因素方差分析，结果见表6。由此可知，与灭菌前比较，湿热灭菌后盐酸麻黄碱、苦杏仁苷含量降低(P<0.05),而60Co辐照灭菌后各成分含量均无明显变化(P>0.05)。

2.5 化学计量学研究

2.5.1 主成分分析

将各批样品指纹图谱相对峰面积导入SPSS22.0软件进行主成分分析，发现有2个贡献较大的主成分，累积方差贡献率为77.49%,即能代表原始数据77.49%的信息。以2个主成分的得分向量建立坐标，得到主成分得分图(图5),可知湿热灭菌后样品均分布在FAC1坐标的负值区域，而灭菌前、60Co辐照灭菌后样品均分布在FAC1坐标的正值区域，表明前者与其他样品差异较大，而后两者之间差异较小。

2.5.2 聚类分析

将各批样品相对峰面积导入SPSS22.0软件进行系统聚类分析，采用组间均连法，以欧式平方距离为分类依据，结果见图6。由此可知，当阈值为25时，湿热灭菌后样品聚为一类，其他样品聚为一类；当阈值减小后，灭菌前、60Co辐照灭菌后样品又进一步分为2类，S4、S7、S10、S13聚为一类，S1与60Co辐照灭菌后样品聚为一类，表明湿热灭菌后样品所含成分与其他样品差异较大，而灭菌前、60Co辐照灭菌后样品所含成分较一致，与“2.5.1”项下结果吻合。

3、讨论

3.1 色谱条件优化

本实验发现，以水(含0.1%磷酸)-乙腈为流动相梯度洗脱时分离效果良好，基线平稳。通过全波长扫描和多波长检测发现，在210nm处色谱峰较多，基线平稳，信号强度高，故选择其作为主要检测波长；盐酸罂粟碱、甘草酸铵在250nm处有最大吸收，故采用切换波长模式将这两者检测波长设为250nm。

3.2 提取条件优化

本实验比较了水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯的提取效率，结果显示水提取出极性成分较多，但弱极性者很少；乙醇提取20min前色谱峰数量很少；乙酸乙酯只能提取出40min以后的色谱峰；甲醇提取出的不同极性成分数量最多，响应信号高。

3.3 灭菌工艺比较

本实验建立了止嗽立效丸HPLC指纹图谱，指认了23个共有峰，同时对盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵含量进行了测定。与湿热灭菌比较，辐照灭菌对各成分含量的影响较小，更有利于最大程度保留药材原有成分，能满足相关研究需求，为该技术在其他中药制剂中的应用提供科学依据。

参考文献:

[1]刘文娟,王静岩,张虹,等HPLC法测定止嗽立效丸中盐酸麻黄碱的含量[J].中华中医药学刊,2010,28(6):1322-1323.

[2]成红娟,曲婷丽,刘锐玲,等.HPLC同时测定止嗽立效口服液中盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱含量[J].中成药,2009,31(2);240-242.

[3]赵英奎,木其尔.HPLC方法测定止嗽立效丸中苦杏仁苷含量[J].亚太传统医药,2018,14(8):61-62

[4]戴敬,冯丽,王璐,等.SPE-HPLC法测定止嗽立效丸中吗啡的含量[J].中国药品标准,2011,12(3):181-184.