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藏法合成人工牛黄促进糖尿病创伤愈合的机制研究

2023-12-19 103 上传者：管理员

摘要：目的评价藏法合成的人工牛黄促糖尿病创伤愈合的作用，并探讨其机制。方法通过RAW264.7细胞炎症模型，观察藏法人工牛黄对抗炎因子表达的影响。建立糖尿病大鼠创伤模型，评价藏法人工牛黄对糖尿病创伤的治疗效果。结果藏法人工牛黄在体外可显著促进RAW264.7炎症细胞中白细胞介素(IL)-10mRNA的表达，体内可显著促进创伤组织中IL-10和精氨酸的表达，增加创伤处M2型巨噬细胞的数量，降低IL-1β、肿瘤坏死因子α的表达，促进糖尿病创伤愈合。结论藏法人工牛黄可能是通过促进糖尿病创伤部位巨噬细胞向M2型转化、分泌抗炎因子并抑制促炎症因子的表达来促进创伤的愈合。研究结果为藏法人工牛黄在慢性创伤临床治疗上的应用提供了依据。

关键词：
人工牛黄
创伤愈合
慢性创伤
抗炎因子
机制
糖尿病
藏法
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慢性创伤不仅影响患者的日常生活，还给患者带来持续的经济压力，对人类健康和经济造成较大的影响[1,2]。M1型巨噬细胞与炎症性疾病密切相关，在慢性创伤愈合早期，巨噬细胞表现出M1型促炎表型，参与清除细胞碎片和凋亡的中性粒细胞，释放促炎症因子和趋化因子[3]。随着慢性创伤愈合，巨噬细胞从M1表型转换为M2抗炎表型。经典激活的M1表型逐渐向交替激活的M2表型倾斜，有助于修复过程的顺利进展，这是慢性创伤从炎症阶段过渡到增殖阶段的标志。因此，巨噬细胞型态的转变成为了慢性创伤愈合研究的重点。牛黄是重要的清热解毒中药，能清热解毒、消肿止痛，主治口舌糜烂、痈肿疮疡[4]。《中华本草》藏药卷中记载：人工牛黄具有显著的抗炎和抗病毒作用。现将藏法合成的人工牛黄应用于糖尿病性大鼠慢性创伤的治疗，并探讨其促慢性创伤愈合的机制，为藏法人工牛黄在慢性创伤临床治疗上的应用奠定基础。

1、实验部分

1.1 试药、细胞与动物

Invitrogen TRIzoL试剂(康为世纪生物科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO,美国Thermo Scientific);DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素链霉素双联抗生素、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco);鼠源白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、β-肌动蛋白(β-actin)引物(上海生工生物技术有限公司);RNA逆转录试剂盒、SYBR Green Mix(上海翌圣生物科技有限公司);美宝湿润烧伤膏(汕头市美宝药业有限公司);藏法合成人工牛黄(NH,西藏藏医药大学)。巨噬细胞RAW246.7(美国ATCC)。8周龄♂SD大鼠(上海斯莱克生物科技有限公司，合格证号：20220004006806),体重220～250 g, 饲养于江南大学医学院实验动物中心屏障环境，动物实验经江南大学实验动物委员会批准。

1.2 方法与结果

1.2.1 细胞的培养

巨噬细胞RAW246.7培养于含1%青霉素-链霉素的DMEM高糖完全培养基(含10%胎牛血清)中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞长满培养瓶底部80%时进行传代，培养至对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 藏法人工牛黄对RAW264.7细胞活力的影响

将处于对数生长期的RAW264.7细胞以每孔8×103个接种于96孔板中，待贴壁12 h, 加入不同剂量的藏法人工牛黄，处理24 h后，加入MTT试剂，于37 ℃继续孵育4 h后，每孔加入100 μL DMSO,于37 ℃继续孵育4 h, 用酶标仪于570 nm处检测吸光度，计算细胞活力。细胞存活率=(OD加药-OD空白)/(OD不加药-OD空白)×100%。与对照组比较，0.01～100 μg·mL-1藏法人工牛黄对RAW264.7细胞的活力无显著抑制作用(图1)。因此，该浓度范围可用于评价藏法人工牛黄对RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响。

图1 藏法人工牛黄对RAW264.7细胞活力的影响

1.2.3 藏法人工牛黄对LPS诱导RAW264.7细胞炎症中炎症因子表达的影响

取处于对数生长期的RAW246.7细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板中，分为对照组、模型组和藏法人工牛黄组。细胞培养至贴壁后，模型组加1 μg·mL-1脂多糖(LPS),藏法人工牛黄组加入LPS以及不同浓度的药物(0.01、0.1、1、10、100 μg·mL-1),对照组加入等体积的完全培养基。于37 ℃细胞培养箱中孵育24 h, 使用TRIzol试剂提取各组RNA,再取1 μg逆转录成cDNA后，用SYBR Green进行荧光定量PCR检测，以β-actin作内参，采用2-△△Ct 法计算藏法人工牛黄不同给药剂量对LPS诱导RAW264.7细胞24 h后，炎症因子IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA相对表达量。内参及目的基因引物序列见表1。由图2可知：与对照组比较，模型组IL-10的表达显著降低，IL-1β和IL-6的表达显著升高，表明RAW264.7炎症细胞模型造模成功。与模型组比较，0.01、0.1、1、100 μg·mL-1藏法人工牛黄显著促进炎症因子IL-10的表达(P<0.05、P<0.01);1 μg·mL-1藏法人工牛黄对IL-1β和IL-6的mRNA水平具有显著抑制作用(P<0.05);1、100 μg·mL-1藏法人工牛黄显著促进TNF-α的表达(P<0.05、P<0.01)。

表1 内参及目的基因RT-qPCR引物序列

图2 藏法人工牛黄对IL-10(A)、IL-1β(B)、TNF-α(C)和IL-6(D)mRNA相对表达的影响

1.2.4 藏法人工牛黄对糖尿病大鼠背部创伤愈合的影响

取36只SPF♂SD大鼠，适应性喂养1周后，按70 mg·kg-1剂量ip给予链霉素(STZ)诱导大鼠糖尿病模型。注射STZ 15 d后，如果连续2次血糖超过300 mg·dL-1,认为糖尿病大鼠造模成功。将造模成功的大鼠分为模型组、藏法人工牛黄组和阳性组(美宝湿润烧伤膏),每组12只。用异氟烷麻醉大鼠后，剔除大鼠背部毛发，制作直径约1 cm的皮肤切除模型，在创面部位给药治疗。模型组给予0.9%生理盐水0.2 mL,滴加到创面部位；藏法人工牛黄组给予1 mg·mL-1藏法人工牛黄溶液0.2 mL,均匀滴加到创面部位；阳性组根据说明书涂抹药膏到创面部位。用透明比例尺测量创面直径并拍照，创伤后第6、9、12天取皮肤进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化(IHC)染色分析。创伤愈合率=[(第0天创伤面积-第n天创伤面积)/第0天区域]×100%。由图3A可知：与模型组比较，藏法人工牛黄组在创伤后的第3、6天时的创伤愈合速率无显著差异；在创伤后的第9天，藏法人工牛黄组的创伤愈合率达83%,与模型组(71%)比较具显著差异(P<0.05);在创伤后的第12天，藏法人工牛黄组和阳性组的创伤接近愈合，而模型组的创伤愈合率仅为85%。由图3B可知：藏法人工牛黄组的创伤愈合速度与阳性组的接近；在创伤后第6天，藏法人工牛黄组的创伤开始结痂，而模型组依然呈现不愈合状态；在创伤后第12天，模型组的创伤结痂依然明显，而藏法人工牛黄组和阳性组的皮肤已完全愈合。表明藏法人工牛黄对糖尿病创伤愈合具有较好的促进作用。

1.2.5 藏法人工牛黄对创面皮肤组织病理学的影响

将修整后的创伤位点皮肤组织固定于4%的多聚甲醛中，石蜡包埋，切成厚约5 μm的皮肤组织切片。将经过脱蜡-水化处理的皮肤组织切片放入苏木素溶液染色10 min, 用蒸馏水洗涤(3 min×2),再放入伊红染色30 s, 增色液洗2遍，甩干，中性树脂封片。在显微镜下观察皮肤组织的病理学变化。图4中红色箭头Ⅰ代表炎症细胞，F代表成纤维细胞，BV代表血管。创伤后第6天，与模型组比较，藏法人工牛黄组显示出较厚的肉芽组织，成纤维细胞显著增殖，但炎症细胞的数量明显减少；创伤后第9天，藏法人工牛黄组由于纤维细胞的大量增殖和胶原蛋白大量沉积使肉芽组织变厚，模型组也开始出现成纤维细胞，但仍有炎症细胞存在；创伤后第12天，藏法人工牛黄组和模型组再生出大量血管，但藏法人工牛黄组中可见皮肤组织中创伤部位的血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖伴随着胶原蛋白的沉积，并且创伤部位形成良好的肉芽组织。

图3 各组糖尿病大鼠背部创伤的愈合率(A)和病理图(B)

1.2.6 藏法人工牛黄对创面皮肤组织中IL-10、精氨酸酶1(Arg-1)、IL-1β、TNF-α表达的影响

将皮肤组织制成厚约5 μm的石蜡切片，在60 ℃烘箱中烤切片1 h, 依次进行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、柠檬酸抗原修复、过氧化物酶灭活。BSA封闭20 min后，将IL-10、Arg-1、IL-1β、TNF-α抗体稀释100倍，依次进行一抗、二抗及SABC孵育。成像前使用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精染色液复染。在组织切片上随机选择6个区域进行拍照，图中红色箭头指向阳性表达区域(图5)。在创伤后第6、9、12天，藏法人工牛黄组小鼠创面皮肤中IL-10和Arg-1的表达水平显著高于模型组，且两者的表达水平随创伤的愈合逐渐升高；但随着创伤愈合，模型组IL-10和Arg-1的表达水平无显著变化(图6A、图6B)。这可能与藏法人工牛黄组中慢性创面处巨噬细胞向M2型转化有关。在创伤后第6、9、12天，藏法人工牛黄组和阳性组中IL-1β、TNF-α的表达水平逐渐降低；但模型组中IL-1β、TNF-α的表达变化不显著，表现出持续性的高炎症反应，糖尿病大鼠背部创伤也无显著愈合迹象(图6C、图6D)。可能是由于慢性创伤部位巨噬细胞仍处于M1型态，产生大量促炎症细胞因子，进而导致金属基质蛋白酶升高，创伤部位细胞外基质过度降解，致使创面无法快速恢复。

图4 第6(A)、9(B)、12(C)天时各组大鼠创面皮肤组织的HE染色图(1.×20;2.×400)

图5 各组小鼠创面皮肤组织中IL-10(A)、Arg-1(B)、IL-1β(C)和TNF-α(D)的免疫组化染色图(×400)

图6 创伤后第6、9、12天创面中IL-10(A)、Arg-1(B)、IL-1β(C)和TNF-α(D)阳性表达面积的统计图

1.2.7 藏法人工牛黄对创面皮肤组织中巨噬细胞表型转变的影响

前期处理方法同“1.2.6”中免疫组化步骤。滴加荧光二抗时，为防止荧光淬灭，孵育均在黑暗的湿盒内进行，再使用核染液DAPI对细胞核进行染色，于37 ℃下染色5 min。用抗荧光淬灭剂在避光条件下进行封片并拍照。通过免疫荧光技术对巨噬细胞的特异性标志分子进行染色，可将CD68标记为绿色荧光，将M2型巨噬细胞的特异性标志分子CD163标记为红色荧光，CD68和CD163共染色标记为黄色荧光，代表M2型巨噬细胞。由图7可知：随着慢性创伤愈合，模型组中创伤处黄色的M2型巨噬细胞表达无显著变化；但在藏法人工牛黄组和阳性组中，创伤处黄色的M2型巨噬细胞表达逐渐增多。说明在给药干预后，随着创伤的愈合，慢性创伤部位的巨噬细胞逐渐向M2型转变。

图7 免疫组织荧光CD68和CD163共染色图(A,×400)和创伤后第6、9、12天创面中M2型巨噬细胞阳性表达面积的统计图(B)

1.2.8 统计学的方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，所有试验数据均采用表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、讨论

急性创伤发展的过程可以概括为创面部位止血、炎症浸润阶段、组织再生阶段、组织修复阶段[5]。慢性伤口的炎症期持续时间较长，此阶段的创面可能处于慢性炎症状态，无法自行过渡到组织再生阶段。巨噬细胞在慢性创伤的愈合过程中发挥着至关重要的作用[6]。M1型巨噬细胞可被toll样受体(TLR)配体激活，如脂多糖或干扰素-γ。M1型巨噬细胞不仅具有高抗原呈递和高表达促炎细胞因子如白细胞介素(IL)-23、IL-1和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的特点，还能吞噬凋亡的中性粒细胞，并清除伤口中的病原体或碎片[7]。M2表型被称为愈合相关巨噬细胞，不仅具有下调促炎症因子，还具有免疫调节作用，高表达抗炎细胞因子IL-10、IL-13、转化生长因子以及精氨酸酶1(Arg-1)等，促进炎症消退及病原体免疫逃逸，进而促进组织修复[8]。M1表型在创伤修复的早期参与清除细胞碎片和凋亡的中性粒细胞，但在中后期，主要由具有促修复作用的M2表型发挥作用[9]。随着创伤的愈合，巨噬细胞表达混合M1/M2表型，IL-1β、TNF-α、IL-10的表达水平也逐渐发生改变[10]。失控的炎症和巨噬细胞表型的异常是阻碍伤口闭合的主要原因，因此，药物的干预至关重要。文中发现：藏法人工牛黄可显著促进创伤组织中IL-10、Arg-1的表达。随着创伤的愈合M2型巨噬细胞逐渐增多，藏法人工牛黄组IL-1β、TNF-α的表达逐渐降低。表明藏法人工牛黄可能是通过促进慢性创伤部位巨噬细胞向M2型转变，分泌抗炎因子IL-10,抑制促炎因子IL-1β、TNF-α的表达，来促进糖尿病性慢性创伤的愈合。文中结果为慢性创伤的治疗提供了新的方向，为藏法合成的人工牛黄在临床上治疗慢性创伤的应用提供了参考。

参考文献:

[4]范春兰,张思玉,左泽平,等.基于网络药理学探讨京制牛黄解毒片治疗口腔溃疡的作用机制及实验验证[J].世界科学技术-中医药现代化,2023,25(1):94-106.

[7]刘利萍,张焱皓,李茂,等.调控巨噬细胞极化的相关信号通路及其调节机制研究进展[J].中国免疫学杂志,2021,37(6):747-753.

[9]姜琦,李京蔓,侯亚义.巨噬细胞参与伤口愈合和组织再生的研究进展[J].中国免疫学杂志,2020,36(6):759-766.

基金资助:藏医药“十四五”规划内涵建设二期项目(2022zyygh09);

文章来源:贡却拉姆,文媛媛,旦知才让等.藏法合成人工牛黄促进糖尿病创伤愈合的机制研究[J].华西药学杂志,2023,38(06):639-644.