骨痛灵酊为经典中医外用方剂，收录于2020年《中国药典》一部中，处方组成为：雪上一枝蒿80 g、干姜110 g、龙血竭1 g、乳香5 g、没药5 g、冰片1.5 g, 主要活性成分有二萜生物碱类(乌头碱、附子灵、雪上一支蒿甲素、雷乌宁、宋果灵等)、姜辣素类(6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等)、乳香酸、龙血素A/B、龙脑等。全方配伍有改善微循环、消肿、抗炎、镇痛等作用，临床上用于治疗腰颈椎骨质增生、骨性关节病、风湿性关节炎等症且疗效良好。但部分患者反馈在贴敷骨痛灵酊后皮肤会发生红、痒的不良反应。为此，建议骨痛灵酊的贴敷时间为约1 h。但1 h短时给药方式是否足够骨痛灵酊透皮吸收并发挥良好药效尚无明确实验验证。为更好地指导骨痛灵酊的临床用药，现检测了骨痛灵酊作用于离体大鼠皮肤后，3种指标活性成分的透皮扩散性能和皮层滞留情况。并用大鼠急性炎症足肿胀模型验证了骨痛灵酊短时给药的活体抗炎效果。

1、实验部分

1.1 仪器、试药与动物

LC20AT型高效液相色谱仪(日本岛津);G6160A型质谱仪、1100型高效液相色谱仪(美国Agilent);TSQ Quantum Ultra质谱仪、QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher);6331型PCR仪(德国Eppendorf);RYJ-12药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司)。骨痛灵酊(云南圣科药业，批号：200902、Z53021244、210402);乌头双酯型生物碱提取物、苯甲酰乌头原碱、雪上一枝蒿甲素、6-姜辣素、龙血素A、龙血素B等对照品(中国食品药品检定研究院，批号为：112029-201601、111794-202006、110895-202105、111833-202007、111660-200402、111558-202108);雪上一枝蒿庚素、8-姜酚、10-姜酚对照品(普西奥标物科技有限公司);奇正消痛贴膏(甘肃奇正藏药有限公司，每贴1.2 g, 面积7.5 cm×5 cm);氟比洛芬凝胶贴膏(北京泰德制药股份有限公司);λ-角叉胶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);大鼠白细胞介素(IL)-10 ELISA Kit、肿瘤坏死因子α(TNF-α) ELISA Kit、IL-1 beta ELISA Kit(英国Abcam);Trizol® Reagent(美国Invitrogen);RNase-free water(上海碧云天生物试剂有限公司);PrimeScriptTM RT Master Mix、TB Green Premix Ex Taq II(日本Takara)。SPF级♂SD大鼠(常州卡文斯实验动物有限公司，合格证编号：202118551)约200 g, 动物试验相关的内容和程序都遵守实验动物使用和管理的相关法律法规。

1.2 方法与结果

1.2.1 透皮检测指标成分的确定

采用GL Sciences Inertsuatain色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流速1.0 mL·min-1,柱温30 ℃,以乙腈为流动相A,0.6%甲酸溶液为流动相B,梯度洗脱。质谱采用ESI离子源，自动采集模式，目标点数2.5 Hz·s-1,扫描类型为SCAN,正负极性，分子量扫描范围m/z 100～1200。取骨痛灵酊样品直接过滤，取续滤液作为供试品溶液，上机检测，出峰情况见图1。根据m/z推断部分峰对应的化合物(表1)。在该LC-MS条件下，未确认出乳香、没药和冰片的已知化合物峰。确认峰化合物均来自方剂中的前3味药。通过文献查阅、结合活性成分和药理需求分析，最终选择含量较高且有标准对照品的雪上一枝蒿甲素和6-姜辣素，以及既是有效成分又是毒性成分的乌头碱，作为骨痛灵酊体外透皮药理实验的分析指标化合物。这3种成分可检测度高，既包括了骨痛灵酊的主要药效成分，也包含了可能的毒性成分，具有代表性。

图1 骨痛灵酊的LC-MS图(+TIC SCAN ESI)   

表1 骨痛灵酊LC-MS峰的确认

1.2.2 色谱条件

为更准确地测定3种指标活性成分的含量，分别针对3种成分建立了LC-MS/MS法，均使用Agilent 1100高效液相色谱仪，采用XBridgeTMC8色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm),柱温40 ℃,流速0.3 mL·min-1,进样量5 μL;采用Thermo TSQ Quantun Ultra质谱仪，ESI离子源，雾化器温度200 ℃,鞘气压力为55 Arb, 辅助气压力15 Arb, 离子传输管温度350 ℃。乌头碱和雪上一枝蒿甲素的流动相A为20 mmol·L-1 NH4HCO3水溶液-乙腈(9:1)、流动相B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱(0～3 min、100%A,3～11 min、36%A,11～15 min、100%A);质谱的喷雾电压为4×103 kV,正离子full scan、SRM扫描模式，离子对和碰撞电压分别为m/z 646.280→586.130、38 V(乌头碱)和m/z 344.200→58.110、50 V(雪上一枝蒿甲素)。6-姜辣素的流动相为20 mmol·L-1 CH3COONH4水溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0～3 min、80%A,3～11 min、10%A,11～15 min、80%A);质谱的喷雾电压3×103 kV,负离子full scan、SRM扫描模式，离子对和碰撞电压为m/z 293.21→193.07、11 V。

1.2.3 溶液的制备与线性关系的考察

取乌头双酯型生物碱对照品适量，用0.01%盐酸甲醇溶解并定容，得139.92 μg·mL-1的乌头碱贮备液；取雪上一枝蒿甲素、6-姜辣素对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得到69.02 μg·mL-1的雪上一枝蒿甲素贮备液和496.5 μg·mL-1的6-姜辣素贮备液，置-20 ℃保存。精密吸取上述贮备液，分别置3个10 mL量瓶中，制得乌头碱、雪上一枝蒿甲素、6-姜辣素浓度分别1.3992、0.0690、4.965 μg·mL-1的标准工作溶液，均于4 ℃密封避光保存。用0.01%盐酸甲醇溶液将雪上一枝蒿甲素、乌头碱、6-姜辣素贮备液稀释成不少于5个浓度的对照品溶液，按“1.2.2”项色谱条件进样，记录峰面积，并进行线性回归，得3种指标活性成分的回归方程分别为：Y1=1.59×104X-274.72(r=0.9990)、Y2=1.59×104X+325.65(r=0.9990)、Y3=690.41X+412.42(r=0.9990)。在试验浓度范围内，待测样品的浓度(ng·mL-1)与峰面积有良好的线性关系，回归方程可用于后续含量的计算。

1.2.4 回收率、精密度与稳定性的试验

配制线性范围内高、中、低浓度的对照品溶液，按“1.2.2”项色谱条件进样测定，每个浓度重复测定3次，计算加样回收率。结果雪上一枝蒿甲素、乌头碱、6-姜辣素的加样回收率为92.50%～107.28%,表明方法较准确。配制线性范围内3个浓度点的对照品溶液，每个浓度配制3次，各进样1次，计算得雪上一枝蒿甲素、乌头碱、6-姜辣素各浓度均小于4.64%,表明该方法精密度良好。配制线性范围内3个浓度的对照品溶液，于同一天的3个时间点和连续3 d同一时间分别进样测定，计算各浓度样品的日内RSD均小于19.05%,日间RSD均小于17.32%,表明方法的日内、日间重复性良好。取24 h透皮扩散试验的样品原液，过0.22 μm滤膜，装于进样瓶中，分别于0、1、3、6、12 h时进样测定，计算各时间点的回收率和RSD。样品放置12 h期间，样品中6-姜辣素、雪上一枝蒿甲素、乌头碱的回收率为75.62%～137.75%,RSD均小于16.45%,可认为样品放置12 h内稳定性良好。

1.2.5 累积渗透量的测定

使用大鼠制备离体皮肤，常规麻醉后断颈处死，用电动剃毛刀剃净背部毛发，手术剪剥离背部皮肤，去净皮下脂肪组织，剪至大小适宜，用生理盐水冲洗干净后即刻使用。将离体皮肤分为给药1 h和给药24 h组，每组设3个平行操作。给药1 h组用无尘纸将鼠皮表面水分吸干，将皮肤固定在立式扩散池上，真皮层面向接收池，角质层面向给药池。接收池以8 mL 0.01%盐酸-甲醇生理盐水(3:7)为接收液，转速为250 r·min-1,于37 ℃下保温30 min后，向给药池中加入2 mL骨痛灵酊剂，1 h后用移液枪吸光酊剂。给药24 h组的操作与给药1 h组基本相同，但给药池加入酊剂后不吸出，一直作用到24 h取样结束。分别于实验开始后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h时取样500 μL,同时补充等体积的相同温度空白接收液，排净气泡。取各时间点样品溶液200 μL,过0.22 μm滤膜，装入进样瓶，分别进样测定，带入回归方程计算各成分的含量。3种成分的累计渗透量在两组中的对比折线图见图2。在整个透皮过程中，两给药组中3种活性成分的累积渗透量变化曲线无明显差异。给药后4 h内，3种活性成分的累积渗透量均仅有小幅度升高。给药后4 h, 3种活性成分的累积渗透量开始大幅提高，直到给药后24 h, 升高趋势未见减缓。

图2 雪上一枝蒿甲素(A)、乌头碱(B)和6-姜辣素(C)的累积渗透量折线图 (n=3)  

1.2.6 皮层滞留量的测定

将给药1、8、24 h的鼠皮(每个时间点设3个平行)共9张，沿有效扩散面积剪下，用纯净水洗净表面残留液体，无尘纸吸干水分，鼠皮角质层一面用医用胶带紧密相贴，均匀施加压力后，揭除胶带，可见角质层悉数剥落，重复黏贴和撕离3～5次，每次均以新的胶带黏贴，至鼠皮表面光滑均匀，即可视为角质层完全被胶带黏附，剩余部分为表皮真皮层。将黏贴角质层的胶带剪碎，置50 mL离心管中，加入5 mL 0.01%盐酸甲醇超声提取1 h, 冷却至室温。取1.5 mL提取液，经1.2×104 r·min-1离心15 min, 取上清液200 μL,稀释20倍后，按“1.2.2”项色谱条件，进样测定，计算角质层中雪上一枝蒿甲素、乌头碱和6-姜辣素的含量。将去除角质层后的表皮真皮层剪碎，按上法操作，分别测定表皮真皮层中3种成分的含量。由图3A可知：每种成分在给药1、8、24 h组间的角质层滞留量均无统计学差异。推测这3种成分在1 h给药后，基本就已达到了角质层滞留的饱和量。由图3B可知：雪上一枝蒿甲素与6-姜辣素的滞留量随给药时间增加而呈明显上升趋势，乌头碱在各时长组表皮真皮层的滞留量均很低，且增长趋势不明显。

图3 3种活性成分在角质层(A)和表皮真皮层(B)的滞留量   

1.2.7 骨痛灵酊对大鼠足趾肿胀度的影响

体外透皮实验表明：骨痛灵酊短时给药1 h即可达到较好的透皮吸收效果。骨痛灵酊的主要药效之一是消肿抗炎，现采用注射角叉菜胶引起大鼠足趾肿胀模型，验证骨痛灵酊短时给药的消肿抗炎效果。将70只大鼠均分为正常组、模型组、凝胶(氟比洛芬凝胶贴膏)组、奇正(奇正消痛贴膏)组及骨痛灵酊低、中、高剂量组。分两次给药，分别为造模前1 d和造模后立即给药。正常组与模型组大鼠右后肢足趾浸泡于10 mL生理盐水中，间隔5 min浸泡1次，浸泡6次，每次5 min; 骨痛灵酊组大鼠右后肢足趾浸泡于10 mL骨痛灵酊(含生药0.2025 g·mL-1)中，根据50 min内浸泡的次数来控制剂量，低、中、高剂量组分别浸泡给药2、4、6次，每次5 min, 总时长分别为10、20、30 min; 将氟比洛芬贴膏裁剪成2.5 cm×1.7 cm大小(含氟比洛芬1.25 mg)、奇正消痛贴膏裁剪成2.5 cm×1.5 cm(含药膏0.12 g),分别贴敷于对应组大鼠的右后肢足趾，贴敷30 min。给药1 d后，于大鼠右后肢足跖中部皮下注入1% λ-角叉胶生理盐水悬液，注射体积为每只0.1 mL,正常组注射等体积的生理盐水。造模后各组立即再按上述方法给药一次。造模后1、2、3、4 h, 用足趾容积测量仪测量各组大鼠的足趾容积[1,2]。足趾肿胀度=注射后足趾容积-基础容积；足趾肿胀抑制率=(模型组肿胀度-对照组或药物组肿胀度)/模型组肿胀度×100%。由图4可知：造模前各组大鼠的体重基本相同，造模后5 h(解剖前)各组大鼠的体重均出现了小幅增加(P>0.05),表明造模和给药对实验大鼠的体重无明显影响。由图5可知：骨痛灵酊在造模给药后1 h就能显著降低大鼠的足趾肿胀度(P<0.05),而对照药物在造模给药后2、3 h才有明显效果(P<0.05),提示骨痛灵酊的消肿效果起效更快。

图4 不同试验组大鼠造模前和给药后5 h的体重(n=10)   

1.2.8 骨痛灵酊对大鼠足肿胀组织中炎症相关因子的影响

造模5 h后，ip戊巴比妥钠麻醉大鼠并处死。采集大鼠右后足趾背部皮下组织，液氮中暂存后转移至-80 ℃冰箱中保存。组织匀浆后，用大鼠ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-10的水平[3]。由图6可知：与正常组比较，模型组中IL-1β、TNF-α、IL-10的含量均显著升高(P<0.05),说明造模引起了明显的炎症反应；与模型组比较，凝胶组和骨痛灵酊中、高剂量组对促炎因子IL-1β的释放均有显著的抑制作用(P<0.05);3种药物对TNF-α和IL-10的作用均未见统计学差异，但骨痛灵酊中、高剂量对TNF-α的含量有趋势性下调作用。造模5 h后，提取正常组、模型组和骨痛灵酊高剂量组大鼠造模部位组织中的RNA,采用RT-qPCR检测5-羟色胺(5-HT)、一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6的mRNA水平变化，各成分的引物信息见表2。以2-ΔΔCT法计算各试验样品靶点基因的相对表达水平。由图7可知：造模后大鼠足趾皮下组织中5-HT、iNOS、IL-6的mRNA表达水平较正常组均显著升高(P<0.05);经骨痛灵酊处理后，5-HT、iNOS、IL-6的mRNA水平较模型组明显降低(P<0.05)。

图5 各组大鼠足趾肿胀度(A)和足趾肿胀抑制率(B)的变化(n=10)   

图6 大鼠足趾皮下组织中IL-1β(A)、TNF-α (B)、IL-10(C)的含量   

表2 各成分的引物

图7 大鼠足趾皮下组织中5-HT(A)、iNOS(B)、IL-6(C) 的mRNA相对表达水平   

1.2.9 统计学分析

采用GraphPad Prism v8.0软件进行统计学分析，实验数据以表示。正态和方差齐的多组间比较先采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey检验；不满足正态分布或者方差不齐，采用Kruskal-Wallis H检验进行分析，组间多重比较采用Dunn′s法。P<0.05为差异有统计学意义。。

2、讨论

文中1 h给药组与24 h给药组的累积渗透量无明显差异。可见1 h给药方案足以满足药物渗透的需求，无需持续更长时间的给药。3种活性成分在角质层的药物滞留量明显高于表皮真皮层。由此可推测骨痛灵酊是在快速大量滞留角质层后，再逐步缓慢透过表皮真皮层。此发现可解释骨痛灵酊在临床应用时“短时给药、长效渗透”的药学表现。乌头碱是骨痛灵酊的主要毒性成分，其透皮量和滞留量相对于其他两种成分明显较少。骨痛灵酊持续给药24 h后，折算出乌头碱的皮肤吸收总量远低于200 μg的临床中毒剂量。说明在正常使用情况下，骨痛灵酊对人体是安全无毒的。骨痛灵酊对大鼠足趾肿胀具很好的消肿抗炎效果，且给药累积时长仅30 min, 可见骨痛灵酊短时给药可起到很好的消肿作用。5-羟色胺(5-HT)能促进炎症反应的发生，并通过舒张小血管、增强小血管通透性、收缩非血管平滑肌致使血浆外渗、局部水肿[4]。一氧化氮合酶(iNOS)会在损伤发生时大量表达并合成NO,进而造成血管壁的通透性增加，炎性渗出增多[5]。IL-6是急性炎症早期触发全身炎症反应的最强内源性炎症因子之一，能够催化、放大炎症反应[6]。骨痛灵酊高效的消肿抗炎作用与其对5-HT、iNOS和IL-6的下调作用有关。从药方组成上分析，骨痛灵酊中的多种药味都具有消肿抗炎的功效[7],这些成分的抗炎机制与文中结果基本相符。文中验证了骨痛灵酊1日1贴、每贴1 h的用药方案有效可行且安全无毒，可促进骨痛灵酊在临床上的合理应用。

文章来源:米军,肖鹏,耿越飞等.骨痛灵酊短时给药的透皮特性和抗炎效果研究[J].华西药学杂志,2023,38(06):665-670.