玄麦甘桔制剂主要包括颗粒剂、胶囊剂和含片3种剂型。中国共有生产企业65家，批准文号65个。处方由玄参、麦冬、甘草和桔梗4味药材组成，具有清热滋阴、祛痰利咽的功效，用于阴虚火旺、虚火上浮、口鼻干燥、咽喉肿痛等症的治疗[1,2,3,4]。现行质量标准为2020年版《中国药典》一部，检验项目主要涉及玄参、甘草的薄层色谱鉴别和以哈巴俄苷、甘草酸为指标成分的含量测定。目前市场上麦冬的易混品主要为山麦冬[5,6],二者的质量标准均收载于2020年版《中国药典》一部中，功能与主治相同，均具有养阴生津、润肺清心的功效。其中，麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicas(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根；山麦冬为百合科植物湖北麦冬Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma或短葶山麦冬Liriope muscari(Decne.)Baily的干燥块根。麦冬块根中提取的水溶性麦冬多糖的药理活性强、降血糖效果佳，且对肿瘤有较好的抑制作用，在抗心肌缺血和抗氧化方面也有较好疗效[5]。麦冬与山麦冬在性状上不易区分，通常需要辅助显微、薄层色谱进行鉴别，且市场上麦冬的价格较高，可能存在山麦冬替代麦冬投料生产的情况。经查阅相关文献，麦冬、山麦冬的主要成分均为甾体皂苷类，麦冬主要含麦冬皂苷A、麦冬皂苷D、甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B等，湖北麦冬主要含山麦冬皂苷B,短葶山麦冬主要含短葶山麦冬皂苷C[7,8]。两者的化学物质基础存在差异，若以山麦冬作麦冬使用可能会给制剂有效性、安全性带来不确定的风险。现以山麦冬皂苷B作为掺杂湖北麦冬投料的研究指标，短葶山麦冬皂苷C作为掺杂短葶山麦冬投料的指标，建立了玄麦甘桔制剂中山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的超高效液相色谱-串联质谱法，同时对收集的麦冬、山麦冬药材的专属性进行研究，为玄麦甘桔制剂的整体质量控制和科学监管提供实验依据。

1、实验部分

1.1 仪器与试药

Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱仪、TSQ Endura三重四极杆质谱系统(美国Thermo);1290InfinityⅡ-6470液相质谱联用仪(美国Agilent)。山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、麦冬对照药材、山麦冬(湖北麦冬)对照药材(中国食品药品检定研究院，批号分别为：111907-201804、111908-201102、121013-201711、121136-201803);2022年国家药品监督管理局玄麦甘桔制剂品种抽验工作抽验样品237批次(包含颗粒剂、胶囊剂和片剂，涉及32家生产企业，32个批准文号，其中，颗粒剂229批次，胶囊和含片各4批次；山麦冬药材和麦冬药材共13批，其中，湖北麦冬10批次、麦冬3批次);乙腈、甲酸为质谱纯；其余试剂为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件

采用Ultimate LP-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱(0～1.5 min、45%乙腈，1.5～8 min、45%～95%乙腈),柱温30 ℃,流速0.2 mL·min-1,进样量3 μL。质谱采用电喷雾正离子(ESI+)模式，喷雾电压3100 V,鞘气为20 Arb, 辅助气为10 Arb, 离子传输管温度350 ℃,蒸发温度300 ℃,扫描模式MRM。山麦冬皂苷B的检测离子对为m/z 723.3→269.1和723.3→251.1,碰撞能量分别为24、27 V;短葶山麦冬皂苷C的检测离子对为m/z 893.4→481.1和723.3→463.1,碰撞能量分别为55、53 V。取对照品溶液，进样3 μL,按上述色谱方法测定，色谱峰的信噪比均应大于10:1。

1.2.2 溶液的制备

精密称取12.37 mg山麦冬皂苷B对照品，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得123.7 μg·mL-1山麦冬皂苷B对照品贮备液，再经逐级稀释，制成0.1237 μg·mL-1山麦冬皂苷B对照品溶液。精密称取10.62 mg短葶山麦冬皂苷C对照品，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得106.2 μg·mL-1短葶山麦冬皂苷C对照品贮备液，再经过逐级稀释，得到0.1062 μg·mL-1短葶山麦冬皂苷C对照品溶液。取玄麦甘桔颗粒适量，研细，取约5.0 g, 置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL,称定重量，超声处理(500 W、40 kHz)30 min, 放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。按处方量及工艺制备玄麦甘桔颗粒作为标准样品；用湖北麦冬替代麦冬制备玄麦甘桔颗粒，作为阳性对照样品；制备缺麦冬的玄麦甘桔颗粒，作为阴性对照样品。取上述标准、阳性对照及阴性对照样品，同法制备标准、阳性对照、阴性对照样品溶液。取麦冬、湖北麦冬对照药材适量，粉碎，过二号筛，取1.0 g, 按供试品溶液制备方法操作，即得麦冬、山麦冬对照药材溶液。

1.2.3 专属性的试验

取“1.2.2”项下制备的标准样品、阳性对照样品、阴性对照样品、山麦冬皂苷B对照品、麦冬对照药材、山麦冬对照药材等溶液同时进样，按“1.2.1”项色谱条件测定，记录色谱图。由图1可知：缺麦冬阴性对照样品、标准样品和麦冬对照药材在与山麦冬皂苷B对照品相应的位置上未出现色谱峰；湖北麦冬对照药材和湖北麦冬阳性对照样品均出现与山麦冬皂苷B对照品相应的色谱峰。表明玄麦甘桔制剂中的各药味对山麦冬皂苷B的测定无干扰，专属性较好。

图1 山麦冬皂苷B对照品(A)、阴性对照样品(B)、标准样品(C)、麦冬对照药材(D)、湖北麦冬对照药材(E)、阳性对照样品(F)溶液的提取离子流色谱图   

1.2.4 线性关系与检测限的考察

精密量取山麦冬皂苷B对照品贮备液适量，用甲醇逐级稀释，制得6.185、2.474、0.6185、0.1237、0.0495、0.0247 μg·mL-1的系列对照品溶液。精密吸取上述系列对照品溶液各3 μL,按“1.2.1”项色谱条件进样测定，记录色谱图。以m/z 723.3→269.1离子峰的峰面积为纵坐标、山麦冬皂苷B的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到山麦冬皂苷B的回归方程为：Y=1.8173×105X-1.4134(r=0.9985),0.0247～6.185 μg·mL-1山麦冬皂苷B与峰面积的线性关系良好。按3%、5%、10%、50%、100%的比例将湖北麦冬掺入麦冬药材后，再制备玄麦甘桔颗粒制剂，得到系列掺伪比例的阳性样品。取上述系列掺伪比例阳性样品，按“1.2.2”项方法制备供试品溶液，以山麦冬皂苷B的特征离子峰m/z 723.3→269.1作为检测离子进行检测，结果显示：峰面积随湖北麦冬掺入比例的增加而增加，两者呈线性关系，线性回归方程为：Y=1.2545×103X-1.1184×103(r=0.9987)。以m/z 723.3→269.1作为检测离子进行检测，取线性最低点(24.7 ng·mL-1)进行适量稀释，按信噪比(S/N)约为20进行折算，得到山麦冬皂苷B的仪器检测限为0.064 pg, 方法的检出限为0.11 ng·mg-1。

1.2.5 精密度、重复性和稳定性的试验

取已知含量的玄麦甘桔颗粒供试品溶液(批号：20220303,山麦冬的含量为2.87 μg·mg-1),再按“1.2.1”项色谱条件连续进样6次，记录m/z 723.3→269.1离子流色谱峰的峰面积，计算得峰面积的RSD=2.25%,表明仪器的精密度良好。取玄麦甘桔颗粒内容物适量(批号：20220303),研细，取约5.0 g, 平行制备6份供试品溶液，分别进样测定，记录m/z 723.3→269.1离子流色谱峰的峰面积，计算样品中山麦冬皂苷B的含量。样品中山麦冬皂苷B的平均含量为2.87 μg·mg-1,RSD=1.35%,表明方法的重复性良好。取上述供试品溶液，分别于室温下放置0、2、6、12、18、24 h后进样测定，记录m/z 723.3→269.1离子流色谱峰的峰面积，计算得峰面积的RSD=1.68%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

1.2.6 加样回收率的试验

精密称取已知含量的玄麦甘桔颗粒2.5 g(批号：20220303),平行操作6份，置已精密加入2.474 μg·mL-1山麦冬皂苷B对照品溶液3 mL并蒸干后的具塞锥形瓶中，按“1.2.2”项方法制备供试品溶液，并按“1.2.1”项色谱条件进样测定，以m/z 723.3→269.1的离子流色谱峰的峰面积计算加样回收率。山麦冬皂苷B的平均回收率为92.48%,RSD=1.88%,表明方法的回收率较好(表1)。

表1 回收率试验的结果(μg, n=6)

1.2.7 耐用性的试验

采用不同品牌的液质联用色谱仪(Thermo Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱仪、Agilent 1290 INfinityⅡ-6470液相质谱联用仪)、不同品牌的色谱柱[Ultimate LP-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、CAPCELL C18(100 mm×2.1 mm, 2 μm)]对玄麦甘桔颗粒样品(批号：20220303)分别进行测定，结果一致，均检出山麦冬皂苷B,表明方法的耐用性较好。

1.2.8 限度拟定及结果的判定

参照2020年版《中国药典》四部中“0212药材和饮片检定通则”规定：“药屑及杂质通常不得过3%”。考虑到湖北麦冬与麦冬的性状相近，对湖北麦冬掺入比例10%进行考察。取10批次山麦冬(湖北麦冬),分别以10%的量掺入麦冬，制成10批掺伪湖北麦冬麦10%的麦冬药材。上述掺伪药材再分别与玄参、桔梗、甘草按规定的处方量及方法制成掺伪10%湖北麦冬的模拟样品共10份。按“1.2.2”项方法制备供试品溶液，以特征离子峰723.3→269.1作为检测离子对。结果10份样品中山麦冬皂苷B的浓度为0.09～0.12 μg·mL-1。因此，暂拟定以0.12 μg·mL-1山麦冬皂苷B对照品溶液(相当于掺伪10%湖北麦冬样品浓度)作为判定检出的限度，若供试品中检出山麦冬皂苷B特征成分且峰面积大于对照，则认为掺杂大于10%,以此制定结果判定原则。

1.2.9 样品的含量测定

样品检出结果见表2,样品筛查的典型色谱图见图2。在237批次样品中，25批次样品检出山麦冬皂苷B,均为含糖型颗粒剂，涉及4家生产企业，其中，四川A厂(10批)、云南B厂(12批)、重庆C厂(2批)和重庆D厂(1批),检出率为10.5%。上述企业在生产过程中可能存在掺伪山麦冬(湖北麦冬)或使用山麦冬(湖北麦冬)替代麦冬投料的情况。按掺伪10%湖北麦冬进行折算，山麦冬皂苷B含量应不得过0.63 μg·mg-1。

表2 玄麦甘桔颗粒中检出山麦冬皂苷B的样品及其含量(μg·g-1)

图2 检出山麦冬皂苷B阳性样品(A)、短亭山麦冬皂苷C对照品(B)和未检出短葶山麦冬皂苷C阴性样品(C)溶液的提取离子流色谱图   

2、讨论

采用TLC法对特征成分山麦冬皂苷B进行检查时，存在专属性不强，斑点有干扰等问题，无法准确定量；采用HPLC-ELSD法对山麦冬掺伪进行检查时，仪器灵敏度和专属性均无法满足实验要求。LC-MS/MS法的专属性强、灵敏度高，且样品前处理简单，进样分析时间短，最终采用该法进行实验。曾对不同提取溶剂(甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇、80%乙醇、50%乙醇)的提取效率进行了比较，结果表明：采用甲醇进行提取时，山麦冬皂苷B的含量最高，因此，选择甲醇为提取溶剂。还对提取方式(超声、回流提取)、提取时间(20、30、40 min)、提取体积(10、25、50 mL)分别进行了考察，最终确定供试品溶液制备方法为：加甲醇25 mL超声处理40 min, 过滤。在结果判定方面，参照2020年版《中国药典》四部通则规定“药屑及杂质通常不得过3%”,由于湖北麦冬与麦冬性状相近，暂拟定以湖北麦冬掺入量10%为限度，其特征性成分山麦冬皂苷B的对应浓度为0.12 μg·mL-1。若供试品中检出山麦冬皂苷B特征成分且峰面积大于对照，则认为样品中可能存在掺伪山麦冬(湖北麦冬)投料的情况。237批次样品中共筛查出25批阳性样品，经分析阳性样品中山麦冬(湖北麦冬)掺伪比例约19%～95%,其中，四川A厂部分样品(批号：210501)的掺伪比例达95%。部分批次样品检出山麦冬皂苷B,但低于拟定限度。麦冬与山麦冬的化学成分存在差异，以山麦冬掺伪或替代麦冬投料，导致其物质基础改变，存在潜在用药安全风险。分析其原因可能为：麦冬与山麦冬在性状上不易区分，药材采购与验收人员的专业知识不够全面；市场上麦冬价格高于山麦冬，且成方制剂中无质控项，生产企业主体责任意识不强，利益上驱动导致以山麦冬掺伪或替代麦冬投料生产。建议国家药监局对含麦冬药材的成方制剂开展专项抽验，核实是否存在违规投料生产的情况，同时尽快完善质量标准，加快补充检验方法的研究和审批。文中方法可作为判定玄麦甘桔颗粒中是否存在山麦冬(湖北麦冬)掺伪的依据，为药品安全监管提供了一定的技术支持。

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文章来源:胡亮,周明,王银红等.基于安全监管的玄麦甘桔制剂中麦冬投料真实性的考察[J].华西药学杂志,2023,38(06):700-704.