神经炎症对包括阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）、帕金森症（Parkinson’s disease,PD）等在内的多种急性和慢性神经退行性疾病的发生有着密切联系[1,2,3]，神经炎症[4]产生的主要病因有胶质细胞的激活、血脑屏障的破坏以及外周免疫细胞进入脑实质内等，胶质细胞的过度激活会导致细胞释放多种炎性因子，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子及前列腺素E2等，造成神经元的损伤和变性。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）具有很强的致炎效应，但对神经元不会产生直接的不良反应，而是通过产生大量的肿瘤坏死因子，从而激活胶质细胞间接引起炎症反应。此过程也常被用于体外炎症模型的建立，使用LPS刺激BV-2小胶质细胞，使其活化分泌大量致炎因子如NO、肿瘤坏死因子、前列腺素E2等从而触发炎症反应[5,6]，其中NO常被用于判断炎症反应是否发生的重要指标。

糙叶五加Acanthopanax henryi (Oliv.) Harms又名亨利五加，为中国特有的五加属植物，广泛分布于湖南、湖北、浙江、安徽、甘肃、四川、河北、山西、陕西等地，资源丰富，生于林缘或灌丛中，其根皮作为“五加皮”收载于《湖南省中药材标准》。糙叶五加味辛，性温；具有祛风湿、补肝肾、活血化瘀、壮筋骨等功效，主要用于治疗风湿痹痛、拘挛麻木、筋骨痞软、水肿、跌打损伤、疝气腹痛等[7,8]。本课题组[9,10,11]前期围绕糙叶五加叶、茎、花、果实做了大量相关研究，已证明糙叶五加地上部分中分离的部分化合物具有抗神经炎活性。为了更全面地了解糙叶五加各部分的药理活性，本研究利用BV-2小胶质细胞的体外炎症模型对糙叶五加根的正己烷提取物（AH-RH）、醋酸乙酯提取物（AH-RE）、正丁醇提取物（AH-RB）进行细胞毒性实验和抗炎活性筛选，从活性较好的醋酸乙酯部位（AH-RE）分离得到17个化合物，分别鉴定为(+)-芝麻素（(+)-sesamin,1）、松柏醛（coniferaldehyde,2）、acuminatolide(3）、芝麻素酮（sesaminone,4）、10-二十九烷醇（10-nonacosanol,5）、(±)-N-甲基-4-羟基癸酰胺（rac-N-methyl-4-hydroxydecanamide,6）、罗汉松脂素（matairesinol,7）、(1R,2S,5R,6S)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylenedioxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3,3,0]octane ((1R,2S,5R,6S)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylenedioxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3,3,0]octane,8）、1-辛烯（1-octene,9）、胡椒醇（piperitol,10）、(-)-松脂醇[(-)-pinoresinol,11]、榕醛（ficusal,12）、丁香醛（syringaldehyde,13）、丁香脂醇（syringaresinol,14）、(-)-表丁香脂素[(-)-episyringaresinol,15]、原儿茶醛（protocatechuyl aldehyde,16）、原儿茶酸（protocatechuic acid,17），其中化合物3～10、12、15首次从五加科植物中分离得到，化合物2～12、15～16首次从糙叶五加中分离得到。进一步对分离纯化的化合物1和化合物13进行细胞毒实验和抗神经炎活性研究，发现两者都具有一定的抗神经炎活性，为深入开发应用糙叶五加资源及丰富治疗神经炎潜在药物来源提供了理论依据。

1、材料

1.1 仪器与材料

二氧化碳细胞培养箱（美国赛默飞公司）；酶标仪（美国赛默飞公司）；超导核磁共振仪（德国Bruker公司）；暗箱三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；LC-16P半制备高效液相色谱仪（日本岛津公司）；多级闪蒸器（上海钒帜精密设备有限公司）；Kromasil100-5-C18(250 mm×4.6 mm,5μm；瑞典Nouryon公司）；5C18-MS-II(250 mm×10 mm,5μm；日本Cosmosil公司）；96孔板（海门市天龙实验器材厂）。

1.2 药品试剂

DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL Co.;LPS、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮、唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、Griess试剂购自Sigma-Aldrich；正相色谱硅胶（200～300目）、薄层色谱硅胶H、薄层色谱硅胶G购自青岛海洋化工有限公司；大孔树脂（D-101，天津允开树脂科技有限公司）；羧甲基纤维素钠（上海山浦化工有限公司）；YMC Gel ODS-A-HG(50μm，日本YMC公司）。紫铆因（butein）为韩国圆光大学药学院及天然产物研究室自制（HPLC检测质量分数≥98.5%）。

1.3 药材

糙叶五加根于2019年8月采自湖南省娄底市新化县，经湖南中医药大学药学院刘向前教授鉴定为五加科五加属植物糙叶五加A.henryi (Oliv.)Harms的根。

1.4 细胞株

小鼠BV-2小胶质细胞来源于韩国圆光大学Park Hyun教授实验室。

2、方法

2.1 不同极性溶剂提取物的制备

取糙叶五加根干燥粉碎（10.0 kg），依次用正己烷、醋酸乙酯、正丁醇加热回流提取，滤过，滤液减压回收溶剂得正己烷提取物（AH-RH,89.5 g）、醋酸乙酯提取物（AH-RE,112.0 g）和正丁醇提取物（AH-RB,206.2 g），取10 mg精密称定。

2.2 细胞培养

BV-2小胶质细胞用高糖培养基DMEM（含10%胎牛血清）培养，将培养基置于37℃、5%CO2的培养箱中恒温培养至细胞对数生长期。

2.3 MTT法测定细胞毒性

采用MTT法，将对数生长期小胶质BV-2细胞接种于96孔板中（每孔1×105个细胞），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中温孵培养12 h后，给药组分别加入不同质量浓度的正己烷、醋酸乙酯、正丁醇提取物（终质量浓度分别为50、100、200µg/m L），加入LPS(1µg/m L）进行诱导，阳性对照组中加入LPS以及10μmol/L的对照品紫铆因（butein）。对照组均不加入受试药物及LPS，但加入体积分数为0.1%的DMSO，模型组加入LPS和培养液，空白组不含细胞只加入培养液。继续温孵培养12 h后，取100µL上清液，加入终质量浓度为100 mg/m L的MTT，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育0.5h。形成的甲臜盐使用酸化异丙醇溶解，置摇床上低速振荡10 min，在酶标仪540 nm处测定各孔吸光度（A）值，以未处理组细胞（对照组）的A值所对应的细胞存活率为100%，计算细胞存活率。

2.4 对NO的抑制作用

采用Griess法检测各提取物对LPS诱导下的BV-2小胶质细胞分泌NO的抑制作用。取对数生长期的小胶质（BV-2）细胞，以约1×105个/接孔种于96孔板中，在37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养12 h后，进行给药处理。设定对照组、模型组、阳性对照组及给药组，阳性对照组和给药组分别加入100µL butein及不同浓度的样品溶液，继续在该条件下进行培养1 h后，除对照组外（加入等体积DMSO），其余各组均加入100µL LPS(1µg/m L）进行刺激，温孵12 h后，吸取各处理组细胞培养上清液（100µL）与相同体积的Griess试剂以十字交叉法混匀，在室温下避光反应5～10 min，在540 nm处使用酶标仪测定混合物的A值，计算NO含量。每组设置3个平行实验。

2.5 提取与分离

干燥的糙叶五加根（10.0 kg）粉碎后，用醋酸乙酯加热回流提取2次（2 h/次），合并2次提取液并减压回收溶剂，浓缩得到醋酸乙酯部位（112.0 g）浸膏。

醋酸乙酯部位（110.0 g）经正相硅胶柱色谱依次以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→1∶1）、二氯甲烷-甲醇（200∶1→1∶1）梯度洗脱进行初分，2个洗脱系统分别得到15个组分（Fr.1.1～1.15）和13个组分（Fr.2.1～2.13）。

其中Fr.1.8（石油醚-醋酸乙酯5∶1）经过反复重结晶和纯化得到化合物1(41.4 mg);Fr.1.11（石油醚-醋酸乙酯1∶1）经过反相硅胶柱色谱（20%～100%甲醇梯度洗脱）得到8个亚组分Fr.1.11.1～1.11.8,Fr.1.11.4经反相硅胶柱色谱（40%甲醇等度洗脱）得到化合物2(2.5 mg),Fr.1.11.5(45%甲醇等度洗脱）和Fr.1.11.8(70%甲醇等度洗脱）分别经过半制备液相进一步纯化得到化合物3(6.6 mg）和4(1 mg);Fr.1.12（石油醚-醋酸乙酯1∶1）经过反相硅胶柱色谱（30%～100%甲醇梯度洗脱）得到5个亚组分Fr.1.12.1～1.12.5,Fr.1.12.3经过半制备液相（60%甲醇等度洗脱）得到化合物5(6.4mg）和6(6.7 mg),Fr.1.12.4(56%甲醇等度洗脱）和Fr.1.12.5(50%甲醇等度洗脱）分别经过半制备液相进一步分离纯化得到化合物7(24.7 mg）和8(1.6 mg);Fr.1.13（石油醚-醋酸乙酯1∶1）经反相硅胶柱色谱（30%～100%甲醇梯度洗脱），得2个亚组分Fr.1.13.1～1.13.2，这2个亚组分再分别经过半制备液相色谱（50%和60%甲醇等度洗脱）得到化合物9(0.4 mg）和10(11.9 mg);Fr.1.14（石油醚-醋酸乙酯1∶1）经反相硅胶柱色谱（20%～100%甲醇梯度洗脱），得2个亚组分Fr.1.14.1～1.14.2，其中Fr.1.14.1经半制备液相色谱（56%甲醇等度洗脱）进一步纯化得到化合物11(3.3 mg);Fr.1.15（石油醚-醋酸乙酯1∶1）经反相硅胶柱色谱（10%～100%甲醇梯度洗脱），得4个亚组分EFr.1.15.1～1.15.4，其中EFr.1.15.2经半制备液相色谱（60%甲醇等度洗脱）进一步纯化，得到化合物12(0.2 mg）。

Fr.2.4（二氯甲烷-甲醇100∶1）经反相硅胶柱色谱（30%～100%甲醇梯度洗脱），得2个亚组分Fr.2.4.1～2.4.2，其中EFr.2.4.1经半制备液相色谱（50%甲醇等度洗脱）分离得到化合物13(1.6 mg),Fr.2.4.2经半制备液相（50%甲醇等度洗脱）得到化合物14(10.5 mg）和15(1.4 mg);Fr.2.7（二氯甲烷-甲醇100∶1）经反相硅胶柱色谱（30%～100%甲醇梯度洗脱），得2个亚组分EFr.2.7.1～2.7.2,EFr.2.7.1经半制备液相（42%甲醇等度洗脱）得到化合物16(2.5 mg);Fr.2.8（二氯甲烷-甲醇50∶1）经反相硅胶柱色谱（30%～100%甲醇梯度洗脱），得3个亚组分EFr.2.8.1～2.8.3，其中EFr.2.8.2经半制备液相（48%甲醇等度洗脱）得到化合物17(4.8 mg）。

2.6 统计学分析

所有数据应用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，结果以表示，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1 结构鉴定

化合物1：白色针晶（醋酸乙酯）。1H-NMR (500MHz,C3D6O) δ:6.90 (2H,d,J=1.7 Hz,H-2,2'),6.87(2H,dd,J=8.0,1.7 Hz,H-6,6'),6.80 (2H,d,J=7.9Hz,H-5,5'),5.97 (4H,s,-OCH2O-×2),4.68 (2H,d,J=4.1 Hz,H-7,7'),4.20 (2H,dd,J=9.1,7.0 Hz,H-9α,9'α),3.82 (2H,dd,J=9.2,3.8 Hz,H-9β,9'β),3.10～3.02 (2H,m,H-8,8');13C-NMR (125 MHz,C3D6O) δ:148.8 (C-4,4'),147.8 (C-3,3'),136.8 (C-1,1'),120.1 (C-6,6'),108.7 (C-5,5'),107.3 (C-2,2'),101.9 (-OCH2O-×2),86.4 (C-7,7'),72.2 (C-9,9'),55.3 (C-8,8')。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物1为(+)-芝麻素。

化合物2：黄色结晶粉末。1H-NMR (600 MHz,C3D6O) δ:9.64 (1H,d,J=7.7 Hz,H-1),7.57 (1H,d,J=15.8 Hz,H-3),7.38 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2'),7.21(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6'),6.92 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5'),6.65 (1H,dd,J=15.8,7.7 Hz,H-2),3.93 (3H,s,-OCH3)。13C-NMR (150 MHz,C3D6O) δ:193.9 (C-1),154.0 (C-3),150.8 (C-4'),148.9 (C-3'),127.5 (C-1'),127.1 (C-2),124.8 (C-6'),116.2 (C-5'),111.6 (C-2'),56.4 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物2为松柏醛。

化合物3：无色针晶（甲醇-水）。1H-NMR (600MHz,CDCl3) δ:6.84 (1H,s,H-6),6.79 (2H,s,H-2,3),5.97 (2H,s,-OCH2O),4.60 (1H,d,J=6.8 Hz,H-7),4.53～4.46 (1H,m,H-9β),4.38～4.28 (2H,m,H-9'β,9α),4.19 (1H,dd,J=9.4,3.7 Hz,H-9'α),3.43 (1H,td,J=8.9,3.8 Hz,H-8),3.13～3.04 (1H,m,H-8')。13C-NMR和DEPT谱图数据提示有13个碳信号，分别对应结构中的13个碳原子。13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ:178.2 (C-7'),148.4 (C-5),147.9 (C-4),132.9(C-1),119.8 (C-2),108.5 (C-3),106.5 (C-6),101.4 (-OCH2O-),86.2 (C-7),70.2 (C-9),69.9 (C-9'),48.5 (C-8),46.2 (C-8')。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物3为acuminatolide。

化合物4：淡黄色粉末。1H-NMR (600 MHz,CDCl3) δ:7.53 (1H,dd,J=8.2,1.7 Hz,H-6),7.45 (1H,d,J=1.7 Hz,H-2),6.97 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2'),6.89(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.84 (1H,dd,J=7.9,1.5 Hz,H-6'),6.78 (1H,d,J=7.9 Hz,H-5'),6.07 (2H,s,3,4-OCH2O-),5.96 (2H,s,3',4'-OCH2O-),4.60 (1H,d,J=9.0 Hz,H-7'),4.29～4.24 (1H,m,H-9β),4.16～4.14(2H,m,H-9α),4.14～4.12 (1H,m,H-8),3.73 (1H,dd,J=11.2,4.8 Hz,H-9'β),3.65 (1H,dd,J=11.2,5.8 Hz,H-9'α),2.89 (1H,m,H-8');13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ:196.3 (C-7),170.9 (C=O),152.4 (C-4),148.7(C-3),148.2 (C-3'),147.7 (C-4'),134.0 (C-1'),131.5(C-1),124.9 (C-6),120.6 (C-6'),108.4 (C-2),108.3 (C-5),108.2 (C-5'),107.3 (C-2'),102.2 (-OCH2O-),101.2(-OCH2O-),84.2 (C-7'),71.1 (C-9),63.2 (C-9'),50.3 (C-8'),49.6 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物4为芝麻素酮。

化合物5：白色粉末。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ:3.67 (1H,s,H-10),0.89 (6H,t,J=6.6 Hz,CH,H-1,29);13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ:71.1 (C-10),37.1(C-9,11),31.6 (C-3,27),24.9 (C-8,12),22.5 (C-2,28),14.0 (C-1,29)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物5为10-nonacosamnol。

化合物6：黄色粉末。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ:5.86 (1H,t,J=17.2 Hz,-NH),3.69 (1H,s,H-4),2.86(1H,dd,J=18.0,6.7 Hz,-OH),2.54 (1H,dd,J=18.0,3.9 Hz,H-1'),2.35 (3H,m,H-2),1.66 (4H,m,H-3),1.56～1.49 (2H,m,H-5),1.43～1.28 (8H,m,H-6～9),0.91 (3H,t,J=6.8 Hz,H-10);13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ:174.8 (C-1),71.8 (C-4),37.7 (C-5),33.2 (C-3),32.2 (C-2),31.6 (C-8),29.0 (C-7),28.9 (C-10),27.8(C-1'),25.2 (C-6),22.5 (C-9),14.0 (C-11)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物6为(±)-N-甲基-4-羟基癸酰胺。

化合物7：淡黄色油状物。1H-NMR (600 MHz,C3D6O) δ:6.72 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5'),6.69 (1H,d,J=2.2 Hz,H-5),6.68 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2'),6.58(1H,d,J=2.0 Hz,H-6'),6.57 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),4.10 (1H,dd,J=8.8,7.3 Hz,H-9a),3.91～3.86 (1H,m,H-9b),3.80 (3H,s,3'-OCH3),3.79 (3H,s,3'-OCH3),2.93 (1H,dd,J=14.0,5.3 Hz,H-7'a),2.68～2.60 (2H,m,H-8'),2.54 (1H,d,J=2.4 Hz,H-7),2.53～2.50 (1H,m,H-8)。13C-NMR和DEPT谱图数据提示有20个碳信号，分别对应结构中的20个碳原子。13C-NMR(150 MHz,C3D6O) δ:179.0 (C-9'),148.3 (C-3'),148.3(C-3),146.2 (C-4'),146.0 (C-4),131.1 (C-1),130.5 (C-1'),122.9 (C-6'),122.0 (C-6),115.7 (C-5),115.6 (C-5'),113.7 (C-2'),113.0 (C-2),71.6 (C-9),56.2 (3-OCH3),56.2 (3'-OCH3),47.0 (C-8'),42.2 (C-8),38.4 (C-7),35.1 (C-7')。以上数据与文献报道基本一致[18,19]，故鉴定化合物7为罗汉松脂素。

化合物8:1H-NMR (600 MHz,C3D6O) δ:6.92(1H,d,J=1.7 Hz,H-2'),6.89 (2H,m,H-5'),6.81 (2H,m,H-6'),6.73 (1H,m,H-2''),4.66 (2H,dd,J=25.4,4.8 Hz,H-2,6),4.21 (2H,m,H-4a,8a),3.81 (2H,m,H-4b,8b),3.06 (2H,m,H-1,5)。13C-NMR和DEPT谱图数据提示有19个碳信号，分别对应结构中的19个碳原子。13C-NMR (150 MHz,C3D6O) δ:147.9(C-3'),146.9 (C-4'),143.8 (C-3''),142.1 (C-4''),136.1(C-1'),133.6 (C-1''),119.2 (C-6'),117.5 (C-6''),114.4(C-5''),113.6 (C-2''),107.8 (C-5'),106.4 (C-2'),101.1(O-CH2-O),85.6 (C-2),85.5 (C-6),71.5 (C-4),71.1 (C-8),54.6 (C-1),54.3 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物8为(1R,2S,5R,6S)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylene-dioxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3,3,0]octane。

化合物9：白色结晶（甲醇-水）。1H-NMR (600MHz,CDCl3) δ:5.54 (2H,s,H-1),3.98 (1H,s,H-2),3.67 (1H,s,H-3)。13C-NMR和DEPT谱图数据提示有8个碳信号，分别对应结构中的8个碳原子。13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ:143.3 (C-2),114.0 (C-1),36.7 (C-3),31.9 (C-6),29.7 (C-5),29.4 (C-4),22.7 (C-7),14.1 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物9为1-辛烯。

化合物10：白色粉末。1H-NMR (600 MHz,C3D6O) δ:6.93～6.84 (2H,m,H-2,6'),6.83-6.76 (2H,m,H-5,3'),6.71 (2H,d,J=8.0 Hz,H-6,2'),5.97 (2H,s,-OCH2O),4.65 (2H,dd,J=24.9,4.7 Hz,H-7,7'),4.22 (1H,d,J=6.3 Hz,H-9β),4.17 (1H,d,J=6.3 Hz,H-9'β),3.83～3.76 (3H,m,-OCH3),3.04 (2H,brs,H-8,8')。13C-NMR (150 MHz,C3D6O) δ:148.8 (C-4'),147.8 (C-4),145.9 (C-3'),145.2 (C-3),137.0 (C-1'),134.5 (C-1),120.1 (C-6),118.4 (C-2'),114.2 (C-5'),108.7 (C-5),107.3 (C-2),102.0 (-OCH2O-),86.5 (C-7),86.4 (C-7'),72.4 (C-9),72.0 (C-9'),55.5 (-OCH3),55.2(C-8)。以上数据与文献报道基本一致[22]，故鉴定化合物10为胡椒醇。

化合物11：无色油状物。1H-NMR (500 MHz,CD3OD),6.95 (2H,d,J=1.9 Hz,H-2,H-2'),6.81 (2H,dd,J=8.1,2.0 Hz,H-6,6'),6.77 (2H,d,J=8.1 Hz,H-5,5'),4.71 (2H,d,J=4.4 Hz,H-7,7'),4.23 (2H,dd,J=9.1,6.9 Hz,H-9a,9'a),3.86 (6H,s,2×-OCH3),3.77 (2H,dd,J=9.1,3.7 Hz,H-9b,9'b),3.19～3.08(2H,m,H-8,8')。13C-NMR (125 MHz,CD3OD),149.1(C-3,3'),147.3 (C-4,4'),133.8 (C-1,1'),120.1 (C-6,6'),116.1 (C-5,5'),110.9 (C-2,2'),87.5 (C-7,7'),72.6 (C-9,9'),56.4 (2×-OCH3),55.4 (C-8,8')。以上数据与文献报道基本一致[23]，故鉴定化合物11为(-)-松脂醇。

化合物12：淡黄色油状物。1H-NMR (500 MHz,C3D6O) δ:9.84 (1H,s,H-7'),7.53 (1H,dd,J=1.5,1.0Hz,H-2'),7.43 (1H,d,J=1.5 Hz,H-6'),7.06 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.83 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.80(1H,dd,J=8.1,2.2 Hz,H-6),5.70 (1H,d,J=6.8 Hz,H-7),3.93 (3H,s,3'-OCH3),3.85 (2H,d,J=5.1 Hz,H-9),3.83 (3H,s,3-OCH3),3.63 (1H,m,H-8)。13C-NMR和DEPT数据证实了18个碳的存在。13C-NMR (125MHz,C3D6O) δ:191.0 (C-7'),154.9 (C-4'),148.5 (C-4),147.7 (C-3'),145.8 (C-5'),133.4 (C-1),132.4 (C-1'),131.2 (C-3),121.5 (C-2'),119.8 (C-6),115.8 (C-5),113.3 (C-6'),110.6 (C-2),89.9 (C-7),64.2 (C-9),56.3(-OCH3),56.3 (-OCH3),53.8 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[24,25]，故鉴定化合物12为榕醛。

化合物13：白色粉末。1H-NMR (600 MHz,C3D6O) δ:9.82 (1H,s,-CHO),7.24 (2H,s,H-2,6),3.92(6H,s,-OCH3×2)。13C-NMR和DEPT谱图数据提示有9个碳原子。13C-NMR (150 MHz,C3D6O) δ:191.1 (-CHO),149.0 (C-3,5),143.2 (C-4),129.1 (C-1),107.8 (C-2,6),56.7 (OCH3×2)。以上数据与文献报道基本一致[26]，故鉴定化合物13为丁香醛。

化合物14：淡黄色油状物。1H-NMR (600 MHz,C3D6O) δ:7.11 (2H,s,4,4'-OH),6.68 (4H,s,H-2,2',6,6'),4.67 (2H,d,J=2.9 Hz,H-7,7'),4.29～4.16 (2H,m,H-9,9'),3.82 (12H,s,OCH3-3,3',5,5'),3.10 (2H,s,H-8,8')。13C-NMR和DEPT谱图数据提示结构中有22个碳原子。13C-NMR (150 MHz,C3D6O),148.7(C-3,3',5,5'),136.2 (C-4,4'),133.3 (C-1,1'),104.5(C-2,2',6,6'),86.8 (C-7,7'),72.4 (C-9,9'),56.7 (3,3'-OCH3,C-5,5'),55.3 (C-8,8')。以上数据与文献报道基本一致[27,28]，故鉴定化合物14为丁香脂醇。

化合物15：白色粉末。1H-NMR (600 MHz,C3D6O) δ:7.08 (2H,d,J=13.3 Hz,H-2',6'),6.69 (2H,s,H-2,H-6),4.83 (1H,d,J=5.9 Hz,H-7),4.36 (1H,d,J=7.0 Hz,H-7'),4.13 (1H,d,J=9.5 Hz,H-9a),3.86(2H,dd,J=9.7,3.5 Hz,H-9b,9'b),3.83 (12H,s,H-3,3',5,5'-OMe),3.22 (1H,t,J=8.7 Hz,H-8)。13C-NMR和DEPT谱图数据提示结构中有22个碳原子。13C-NMR (150 MHz,C3D6O) δ:148.7 (C-3',5'),148.6 (C-3,5),136.3 (C-1'),135.7 (C-4'),133.4 (C-4),130.4 (C-1),104.5 (C-2',6'),104.1 (C-2,6),88.7 (C-7'),82.8 (C-7),71.6 (C-9),70.2 (C-9'),56.7 (3,3',5,5'-OMe),55.7(C-8'),50.9 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[29]，故鉴定化合物15为(-)-表丁香脂素。

化合物16：灰白色粉末。1H-NMR (500 MHz,C3D6O),9.78 (1H,s,-CHO),7.36 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2),7.34 (1H,d,J=1.9 Hz,H-6),7.00 (1H,d,J=7.9Hz,H-5)。13C-NMR和DEPT谱图数据提示有7个碳信号，分别对应结构中的7个碳原子。13C-NMR (125MHz,C3D6O),191.2 (-CHO),152.3 (C-4),146.4 (C-3),131.0 (C-1),125.5 (C-6),116.1 (C-2),115.1 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[30,31]，故鉴定化合物16为原儿茶醛。

化合物17：褐色结晶性粉末。1H-NMR (600MHz,C3D6O) δ:7.53 (1H,s,H-2),7.48 (1H,d,J=8.2Hz,H-6),6.90 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5)。13C-NMR和DEPT谱图数据提示有7个碳信号，分别对应结构中的7个碳原子。13C-NMR (150 MHz,C3D6O)δ:167.8 (-COOH),150.7 (C-4),145.5 (C-3),123.7(C-6),123.1 (C-1),117.5 (C-2),115.7 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[32]，故鉴定化合物17为原儿茶酸。

3.2 糙叶五加根提取物抗神经炎活性筛选研究

3.2.1 糙叶五加根各提取物在LPS诱导的BV-2小胶质细胞模型下的细胞毒性

为了明确糙叶五加根AH-RH、AH-RE、AH-RB对BV-2细胞的影响，通过MTT法测定不同浓度的糙叶五加根各提取物有无细胞毒性，以确定安全的药物浓度。MTT实验表明（图1），各组受试药物的不同质量浓度均能提高由LPS诱导细胞炎症所降低的细胞活力，且细胞存活率均大于60%，因此，可将50、100、200µg/m L作为后续实验所用药物浓度梯度。

图1 糙叶五加根各提取物对BV-2小胶质细胞的影响n=3)   

3.2.2 糙叶五加根各提取物对BV-2小胶质细胞中NO的影响

炎症反应的发生伴随着大量NO的生成，因此，NO被广泛用作判断炎症反应是否发生的筛选指标。本研究以LPS诱导的BV-2小胶质细胞产生NO为模型对糙叶五加根各粗提物进行抗炎活性初筛，结果如图2所示，与对照组比较，模型组NO浓度显著升高；与模型组相比，各粗提物均可显著降低NO水平，其中AH-RE的抑制效果最佳，当AH-RE的药物浓度为100µg/m L时，NO水平最低（2.099µmol/L）。因此，后续实验重点对AH-RE部位分离纯化的化合物进行探讨和研究，进一步明确其发挥抗神经炎作用的主要活性成分。

3.3 糙叶五加根中化合物1和13的抗神经炎活性验证

根据上述各粗提物抗神经炎活性初步筛选结果，对活性较好的AH-RE部位进一步分离纯化得到17个化合物，其中分离得到的化合物1、13分别被鉴定为芝麻素（sesamin）和丁香醛（syringaldehyde）。芝麻素是从芝麻中提取出来的一种木脂素，现代研究表明，芝麻素具有抗氧化、抗衰老、调血脂、抗高血压等作用[33,34,35]；丁香醛是一种黄酮类多酚化合物，具有抗氧化、抗高血糖等多种生理活性[36,37]。本课题组前期相关研究发现，从糙叶五加果实中分离的木脂素类对小胶质细胞中NO的产生具有良好的抑制作用[38]。有研究指出，多酚类物质及其代谢产物能够通过血脑屏障发挥神经保护效应[39,40]。因此，本研究以分离自糙叶五加根AH-RE部位的化合物芝麻素和丁香醛为主要研究对象，基于LPS诱导的BV-2小胶质细胞作为抗神经炎活性筛选模型，分别对两者所设定的药物浓度区间进行了细胞毒实验并测定了其对由LPS诱导的BV-2小胶质细胞产生NO的抑制作用，初步挖掘芝麻素和丁香醛的抗神经炎的潜在活性能力。

图2 糙叶五加根各提取物对NO抑制作用   

3.3.1 芝麻素和丁香醛在LPS诱导的BV-2小胶质细胞模型下的细胞毒性

根据实验结果可知（图3、4），在5～80µmol/L下，与对照组相比，芝麻素和丁香醛以此工作浓度梯度对BV-2细胞进行干预会对该细胞系的细胞活力产生一定影响但存活率均大于50%，因此，可将5～80µmol/L的药物浓度设置为后续实验的浓度梯度。

3.3.2 芝麻素和丁香醛对BV-2小胶质细胞中NO的影响

根据实验结果可知（图5、6），与对照组相比，模型组的NO水平明显升高，与模型组相比，不同浓度（5～80µmol/L）的芝麻素和丁香醛对BV-2细胞处理后，NO水平均呈剂量相关性下降，表明芝麻素和丁香醛均能抑制NO的生成，意味着芝麻素和丁香醛对神经炎可能有一定的治疗作用。

4、讨论

《湖南省中药地方标准》将糙叶五加根以“五加皮”收载，是一种具有祛风湿、滋补肝肾、活血化瘀之功效的抗风湿药物。本课题组已围绕糙叶五加叶、花、果实、根茎等做了大量研究，表明糙叶五加具有良好的抗炎活性。结合本研究前期对各粗提物的抗炎实验的初步筛选，表明糙叶五加根醋酸乙酯提取物有更好的抗炎效果。因此，本研究进一步就糙叶五加根AH-RE的化学成分进行毒性、抗神经炎作用方面的研究。通过常规分离手段，共分离得到17个化合物，包括10个木脂素类、3个酚类、1个苯丙素类、3个其他类化合物。为了进一步明确糙叶五加根抗神经炎的主要活性成分，结合本课题组前期的研究成果，选取分离自抗炎活性最佳的AH-RE部位中的化合物芝麻素和丁香醛，利用LPS刺激BV-2小胶质细胞产生NO的体外炎症模型对其进行抗炎活性验证，结果表明，证明芝麻素和丁香醛具有一定的抗炎活性，可作为潜在的抗神经炎药物进行开发。通过此实验，进一步对糙叶五加的化学成分和药理活性有了更全面的认识，明确其抗神经炎作用的药效物质基础，为糙叶五加根的合理使用及深层次的开发利用奠定理论基础。

图3 芝麻素对BV-2小胶质细胞的影响  

图4 丁香醛对BV-2小胶质细胞的影响   

图5 芝麻素对BV-2小胶质细胞中NO的影响  

图6 丁香醛对BV-2小胶质细胞中NO的影响   

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基金资助:湖南省自然科学基金项目(2024JJ7357);湖南省科技厅普惠性政策与创新环境建设计划项目(2022ZK4039);湖南中医药大学“十四五”重点学科-生物工程学科(校行发规字[2023] 2号); 湖南省研究生科研创新项目(QL20220186);

文章来源:陈杨,肖瑾,蒋诗琴,等.基于BV-2小胶质细胞模型导向分离糙叶五加根的化学成分[J].中草药,2024,55(08):2533-2541.