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HPLC同时测定注射用丹参多酚酸中三种药效成分的含量

2024-07-09 104 上传者：管理员

摘要：目的注射用丹参多酚酸中三种药效成分丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量测定方法的建立及应用。方法采用HPLC法，色谱柱为Inertsil ODS-3(2.1 mm×100 mm I.D.,3μm);流动相为0.1%甲酸(A)-乙腈(B),梯度条件是：0～45 min:10%～30%B。流速为0.2 mL·min-1;柱温为40℃;检测波长为286 nm。结果丹酚酸A回归方程为Y=102195X-939080,线性范围为12.00～240.00μg·mL-1,r=0.9990;迷迭香酸回归方程为Y=49827X-898867,线性范围为27.00～540.00μg·mL-1,r=0.9995;紫草酸回归方程Y=50025X-1000000线性范围为36.00～720.00μg·mL-1,r=0.9995,三种成分的加标回收率在88.82%～110.34%。测定了同一厂家生产的10种不同批次的注射用丹参多酚酸，得到丹酚酸A的含量在14.61～15.38μg·mL-1之间；迷迭香酸的含量在42.08～58.98μg·mL-1之间；紫草酸的含量56.32～64.63μg·mL-1之间。结论该方法灵敏、准确、专属性强，可用于注射用丹参多酚酸中的丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸含量的测定，适用于注射用丹参多酚酸的质量评价。

关键词：
含量测定
注射用丹参多酚酸
紫草酸
迷迭香酸
高效液相色谱法
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中药注射剂是在中医理论指导下，采用现代科学技术，将中药饮片提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液及供临用前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂[1]。与丸剂，膏剂等传统中药剂型相比，具有起效快，生物利用度高等优点，尤其在心血管疾病、恶性肿瘤等复杂疾病的治疗中发挥着不可替代的作用[2,3,4]。注射用丹参多酚酸是基于我国中医药数千年的发展，取其精华，外加以先进的现代工艺为基础，将丹参的提取物进行配液，滤过，罐装，灭菌等一系列操作，加工制成的一种统一规格、统一剂量、统一质量标准的中药注射剂，适用于治疗心脑血管疾病[5,6,7]。注射用丹参多酚酸还被用于减缓脑梗死患者的病势发展[8,9,10,11];与化学药物联合使用用于治疗合并的心脑血管疾病[12,13,14];研究还发现注射用丹参多酚酸在脑缺血再灌注损伤中具有脑功能保护作用[15]。因此，注射用丹参多酚酸在临床上应用广泛。

注射用丹参多酚酸的有效成分是丹参中水溶性成分丹参多酚酸，以其制成冻干粉针剂，成分包括丹参素钠、丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、丹酚酸A以及丹酚酸U/T等，其中以丹酚酸B的含量最高[16,17,18]。《中华人民共和国药典》以丹酚酸B与迷迭香酸作为丹参总酚酸提取物的定量指标[19]。除丹酚酸B和迷迭香酸之外，研究发现丹酚酸A具有抗心肌缺血[20]、抗肝硬化[21]、抗肿瘤[22]、改善学习记忆损伤[23]等多种药理作用。对心绞痛、急性心肌梗死、视网膜中央动脉栓塞、血栓闭塞性脉管炎等有治疗作用。因此，仅控制丹酚酸B和迷迭香酸这两种成分的含量难以对中药的多药效成分进行综合评价。因此，简单方便地可以同时测定多种主要成分含量的方法对其质量控制及应用具有重要意义。高效液相色谱法(HPLC)因其样品前处理简单，操作方便，易于实现自动化和过程检测，在不同产地的中药材质量分析、中药的指纹图谱及中药注射剂中有效成分的测定中均有广泛的应用[24,25,26]。

本实验采用HPLC法，建立了同时测定注射用丹参多酚酸中丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸三种主要成分含量的方法，对该定量方法进行方法学考察后将其应用于三种成分的含量测定，为注射用丹参多酚酸多指标成分的定量控制提供参考，对其更好的进行临床应用具有一定意义。

1、仪器与试药

1.1 仪器

SHIMADZU LC-2040C3D高效液相色谱仪(日本岛津科学仪器有限公司);Sartorius 1712型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);富勒姆FCR1002-UF超纯水制备机(青岛富勒姆科技有限公司);QL-901涡旋混匀仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);移液枪(德国Eppendorf);SB-5200DTD超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸对照品(纯度>98%,成都普菲德生物技术有限公司);甲酸(分析纯，无锡宜兴第二化学试剂厂);乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific);血必净注射液为市售药品；水为超纯水；注射用丹参多酚酸粉针剂(天津天士力之娇药业有限公司)。

2、方法与结果

2.1供试品溶液的制备

称取注射用丹参多酚酸粉针剂(批号：20201005)适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容成1 mg·mL-1的溶液，摇匀后作为供试品溶液，进样分析前用0.22 μm水相微孔滤膜过滤。

2.2对照品溶液制备

取丹酚酸A,丹酚酸B、迷迭香酸，紫草酸对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加纯水溶解并稀释成每1 mL中约含丹酚酸A 240 μg, 迷迭香酸540 μg和紫草酸720 μg的溶液，作为混合对照品的储备溶液。

2.3色谱条件与系统适用性试验

Inertsil ODS-3(2.1 mm×100 mm I.D.,3 μm);流动相为0.1%甲酸(A)-乙腈(B),梯度条件为：0～45 min: 10%～30% B,45.01～55 min: 100% B,55.01～65 min: 10% B。流速为0.2 mL·min-1;柱温为40 ℃;检测波长为286 nm; 进样量：5 μL。采用外标法定量，理论塔板数不得低于8000,待测物的色谱峰与相邻共存物之间的分离度不小于1.5,拖尾因子不得大于1.2,且注射用丹参多酚酸中的丹酚酸A,丹酚酸B、迷迭香酸和紫草酸与对照品的保留时间一致，无其他组分干扰，HPLC结果如图1所示。

图1 混合对照品和样品HPLC图

2.4标准曲线的绘制

将“2.2”对照品储液分别取1 mL,0.8 mL,0.5 mL,0.1 mL,0.05 mL置于容量瓶中，加入甲醇分别稀释至1 mL,并按照2.3色谱条件，各进样5 μL,依次注入到高效液相色谱仪，测定峰面积值。以丹酚酸A,迷迭香酸，紫草酸浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线，结果如表1所示。

表1 丹酚酸A,迷迭香酸，紫草酸的回归方程

2.5专属性考察

以稀释用纯水作为空白对照，按照“2.3”色谱条件进样，取混合对照品溶液作为阳性对照，相同色谱条件下，注射用丹参多酚酸的色谱图中混合对照品吸收峰的位置无干扰峰存在。结果如图1所示。

2.6检测限与定量限

将“2.2”混合对照品储液，不断稀释，再分别按照“2.3”色谱方法进行分析，进样量为5μL,根据目测法，找到信噪比为3的浓度即为检测限，信噪比为10的浓度即为定量限。结果如表2～6所示，丹酚酸A检测限为4 μg·mL-1,定量限为12 μg·mL-1;迷迭香酸检测限为8 μg·mL-1,定量限为12 μg·mL-1;紫草酸检测限为9 μg·mL-1,定量限为18 μg·mL-1。

2.7精密度考察

将“2.2”混合对照品溶液取2 mL,置于10 mL容量瓶中，并加入纯水定容，得到每1 mL分别含丹酚酸A 48 μg·mL-1,迷迭香酸108 μg·mL-1,紫草酸144 μg·mL-1的混合对照品溶液，按照2.3项下色谱条件连续进样6次，进样量为5 μL,测得丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和紫草酸的峰面积RSD分别为1.06%、0.86%、1.08%和0.95%,实验结果表明该方法日内精密度良好。按照“2.3”项色谱条件，连续5日各进样分析一次，测得丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰面积RSD为分别为4.02%、3.24%、3.61%和3.27%,结果表明该方法日间精密度良好。

2.8重复性考察

将供试品溶液(注射用丹参多酚酸，批号：20171005)分成六等份，按“2.1”中方法稀释过滤后，按照“2.3”项色谱条件，色谱柱用初始比例流动相充分平衡后，分别进样分析，各进样5 μL,测得丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸三种主要成分的峰面积RSD为0.15%、0.68%和1.80%,结果表明该方法具有良好的重复性。

2.9稳定性考察

将供试品溶液(注射用丹参多酚酸，批号：20171005)放置于4 ℃,并于0,2,4,6,8,12,24 h各进样5 μL,记录各色谱峰面积。丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸峰面积RSD分别为1.30%、0.39%和1.52%,均小于5%。实验结果表明，供试品溶液在24 h内稳定，主要成分含量没有明显的变化趋势。

2.10加标回收率

取同一批(注射用丹参多酚酸，批号：20171005)样品溶液，按照“2.1”条件下稀释至1 mg·mL-1,分成9份，每份1 mL,分为3组，每组分别加入混合对照品溶液，配制成低、中、高三种不同浓度的样品溶液，按照2.3项下色谱条件进行测定，根据样品含量，加入量，测得量，计算丹酚酸A,丹酚酸B,迷迭香酸和紫草酸的加样回收率。实验结果如表2,3,4所示，丹酚酸A平均回收率为107.66%,RSD为2.05%;迷迭香酸平均回收率为94.31%,RSD为3.51%;紫草酸平均回收率为92.36%,RSD为3.56%。

2.11样品的含量测定

取各批次注射用丹参多酚酸样品，按“2.1”项的样品制备方法进行处理，按照“2.3”项色谱条件，各进样5 μL,测定丹酚酸A,迷迭香酸，紫草酸的峰面积，并带入“2.4”项回归方程计算出样品的含量，样品含量测定结果如表5所示。10个不同批号的注射用丹参多酚酸中丹酚酸A的含量在14.61～15.38 μg·mL-1之间，迷迭香酸的含量在42.08～58.98 μg·mL-1之间，紫草酸的含量在56.32～64.63 μg·mL-1之间。

表2 丹酚酸A加标回收率实验结果

表3 迷迭香酸加标回收率实验结果

表4 紫草酸加标回收率实验结果

表5 样品含量测定结果(μg·mL-1)

3、讨论

综上所述-建立的上述HPLC同时测定方法可以同时检测注射用丹参多酚酸中丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸三种成分，方法简单易操作，精密度高，准确性好，为评价注射用丹参多酚酸的质量提供了可靠的方法依据。

在方法建立过程中，丹酚酸A、迷迭香酸，紫草酸均为弱酸性物质，因此，在流动相A中加入了0.1%的甲酸，可以改善峰形及分离度，从而防止在分析过程中出现拖尾的现象。在190～400 nm范围内，三种主要成分在286 nm波长下均有较大吸收，因此实验最终采用286 nm作为检测波长。

参考文献:

[1]何自会,王青,刘沫,等.中药注射剂质量控制研究进展[J].中国医药工业杂志,2021,52(5):599-610.

[2]徐菁,陈乐,孙丹,等.丹参川芎嗪注射液治疗皮肤病研究进展[J].陕西中医药大学学报,2019,42(2):133-136.

[3]刘祚汝.PDCA管理模式在规范基层医院中药注射剂使用中的应用研究[J].陕西中医药大学学报,2019,42(1):64-68.

[4]董子洵,冯佳佳,常佳慧,等.中药注射剂在肿瘤领域的应用研究[J].中国研究型医院,2019,6(5):14-22.