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红花多糖治疗雌二醇诱导的小鼠胸腺萎缩的药效作用研究

2024-10-14 35 上传者：管理员

摘要：目的：雌二醇诱导小鼠胸腺萎缩模型，评价红花多糖治疗胸腺萎缩的药效。方法：75只雌性ICR小鼠分为5组：正常对照组、模型组、乌苯美司组、SPS高、低剂量组，除对照组外，其余各组隔天腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，共6次；药物治疗组于末次注射24 h后开始给药，1次/d，共10 d。末次给药24 h后牺牲小鼠，观察体质量、免疫器官指数、血浆MDA与GST水平、外周血细胞与T细胞变化，并对胸腺组织进行HE染色、TUNEL细胞凋亡染色，检测胸腺输出能力。结果：高、低剂量红花多糖均可显著提高小鼠胸腺指数（P<0.05），提高外周血白细胞数量（P<0.05）、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞比例（P<0.05）及CD4+T/CD8+T，并改善胸腺组织损伤。高剂量红花多糖可显著减少胸腺组织细胞凋亡，并提高胸腺输出能力。结论：红花多糖对雌二醇诱导的小鼠胸腺萎缩具有治疗作用。

关键词：
SPS
治疗作用
红花多糖
胸腺萎缩
雌二醇
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红花又名草红花、红蓝花、刺红花，是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，具有活血通经、散瘀止痛等作用，为我国传统中药材，主产于西藏、云南、新疆、浙江、湖南等地[1]。由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖通过β键连接组成的红花多糖（safflower polysaccharide,SPS）为均一杂多糖，是从红花中提取的重要活性成分[2]。研究表明SPS具有抗肿瘤、调节免疫、抗凝血等药理活性，具有良好的开发价值及临床应用前景[3]。

胸腺细胞性丧失称为胸腺萎缩，发生于压力、营养不良、感染和癌症治疗等情况[4-8]。胸腺萎缩可能由胸腺细胞凋亡、胸腺结构恶化、早期胸腺祖细胞流入胸腺或上述情况组合引起，可能由于对胸腺的直接（如胸腺细胞HIV感染）或间接（如应激诱导的糖皮质激素增加）的影响而发生[9]。胸腺的正常功能对降低各种临床疾病（包括感染和移植）相关发病率和病死率至关重要，因此，治疗干预对降低胸腺萎缩程度，从而增加胸腺输出具有重要意义。本课题组前期发现SPS对苯甲酸雌二醇诱导的小鼠胸腺萎缩具有较好的治疗作用。本研究通过免疫器官指数、外周血细胞分析、病理学检测、胸腺细胞凋亡及胸腺输出能力检测等指标评价SPS对雌二醇诱导的小鼠胸腺萎缩的治疗作用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

75只清洁级雌性ICR小鼠，体质量18～21 g，由杭州医学院提供，动物质量合格证：20200728Abzz0118065743。饲养于屏障级动物房内，温度20～26℃，相对湿度40%～70%,12 h/12 h明暗交替，通风≥15次/h，动物使用设施条件合格证：SYXK（浙）2018-0011。本研究经浙江省中药研究所有限公司实验动物伦理委员会批准（20191101）。

1.1.2 药物与试剂

SPS（浙江永宁药业股份有限公司，批号：20191221），苯酚-硫酸法测定SPS含量，以葡萄糖为标准品，按照标准曲线测定其吸光度，根据标准曲线计算SPS含量，约为39.6%，糖腈乙酸酯衍生化-GC法分析SPS中单糖组成，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-木糖组成；乌苯美司胶囊（百士欣，10 mg/粒，浙江普洛康裕制药有限公司，批号：20190809）；苯甲酸雌二醇注射剂[4 mg/ml，上海全宇生物科技（驻马店）动物药业有限公司，批号：190504];GST、MDA检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20200316、20200218);HE染液（飞净生物科技有限公司，批号：191125);TUNEL检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：080919190826);CD3、CD4、CD8荧光抗体（美国BioGems公司，批号：80E041705122、60E271706122、50M281710112）。

1.1.3 仪器

M200Pro多功能酶标仪（TECAN公司）；全自动血液分析仪（SYSMEX公司）；多功能生物显微镜（LEICA公司）；全套病理学设备，包括染色机、脱水机、包埋机、摊片机、烫片机、切片机（LEICA公司）；流式细胞仪（AGILENT公司）；PCR仪（BioRad公司）；高速冷冻离心机（HITACHI公司）；VOR⁃TEX2涡旋仪（IKA公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模与给药

试验随机分为5组：正常对照组、模型组、乌苯美司组、SPS高、低剂量组，每组15只。除对照组外，其余各组隔天腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液[0.1 mg/（只·d）]，共6次，正常对照组不做注射操作。乌苯美司组、SPS高、低剂量组于末次注射24 h后灌胃给药，1次/d，共10 d（苯甲酸雌二醇诱导的ICR小鼠预实验结果可知，末次造模结束14 d后逐渐恢复，故给药时间选择10 d，确保模型组与正常对照组有显著差异，由于苯甲酸雌二醇为购买的药品，含油状溶剂，不知其具体成分，故正常对照组不做腹腔注射）。SPS高、低剂量组小鼠每日给药剂量为240、120 mg/kg,SPS使用纯净水充分溶解后灌胃。乌苯美司给药剂量：根据小鼠给药剂量为人用每日推荐剂量的10倍进行换算，得小鼠给药剂量为5 mg/kg，研磨成细粉后纯净水超声溶解，灌胃，给药前充分摇匀。

1.2.2 动物处理

造模开始第1、8、13、18、23天称重，末次给药24 h后称重，眼眶取血后迅速脱颈处死，取胸腺、脾称重，计算器官指数，器官指数=器官重量（g）/体质量（g），部分置于中性甲醛用于病理学检测，部分-80℃保存。

1.2.3 血浆MDA、GST含量检测

动物眼内眦取血，置于EDTA-2K抗凝管，涡旋仪慢速摇匀后抽取150µl用于血细胞分析，剩余抗凝血3 000 r/min离心15 min后取上层血浆，根据试剂盒说明书检测MDA、GST。

1.2.4 外周血细胞分析

取抗凝外周血150µl，采用全自动血液分析仪进行白细胞五分类检测。

1.2.5 外周血T细胞分类检测

取100µl抗凝血，加入CD3、CD4、CD8荧光抗体，充分混匀，室温避光孵育15 min，孵育结束后加入1 ml红细胞裂解液，混匀，室温避光处理15 min,500 g离心5 min，弃上清；加入1 ml常温无菌PBS清洗1遍，500 g离心5 min，弃上清，加入0.5 ml常温无菌PBS重悬后流式细胞仪检测。

1.2.6 胸腺HE染色检查

胸腺置于4%甲醛溶液固定1周后制作石蜡切片（5µm），进行HE染色，观察各组胸腺病理学变化。

1.2.7 TUNEL染色检测胸腺细胞凋亡

各组小鼠胸腺组织石蜡切片（5µm）置于黏附载玻片，55℃烘烤2 h，按照TUNEL凋亡染色试剂盒（显色法）说明书检测，凋亡细胞被染成棕褐色。

1.2.8 外周血T细胞受体重排删除环（TRECs）含量检测

外周抗凝血参照试剂盒提取总DNA，计算DNA纯度与浓度，加入荧光反应体系中进行PCR扩增，明确PCR扩增与熔解曲线，得出各孔Ct值，以β-actin为内参。引物序列为TREC F:5'-GAAGCT-GACAGGGCAGGTTT-3',TREC R:5'-TGAGCATGG-GCAAGCAGTACC-3';β-actinF:5'-GAAATCGTGC⁃GTGATCAAAG-3',β-actin R:5'-TGTAGTTTCATGC⁃CACAG-3'。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计学分析。多样本均数比较采用单因素方差分析，检验方差齐性，若方差齐，则两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，则两两比较采用Dunnett T3检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠体质量比较

分组第1天各组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）；第8天正常对照组体质量与其余组差异均有统计学意义（P<0.05）；第13天为末次造模注射24 h后体质量，正常对照组与其余各组差异均有统计学意义（P<0.01），苯甲酸雌二醇造模同时增加小鼠体质量；第18天正常对照组与模型组无显著差异，SPS高剂量组较模型组体质量显著降低（P<0.01，由于称重前1 d该笼小鼠饲料吃完，对体质量造成影响）；第23天各组体质量差异无统计学意义（P>0.05，表1）。

2.2 免疫器官（胸腺、脾脏）指数

结果显示，模型组小鼠胸腺指数较正常对照组显著降低（P<0.01），乌苯美司组、SPS高、低剂量组胸腺指数较模型组显著升高（P<0.01）；各组脾脏指数差异无统计学意义（P>0.05，表2）。

2.3 血浆GST与MDA含量

正常对照组与模型组血浆GST活性差异无统计学意义（P>0.05），乌苯美司组、SPS高剂量组与模型组差异无统计学意义（P>0.05),SPS低剂量组较模型组显著降低（P<0.05）；各组血浆MDA含量差异无统计学意义（P>0.05，表3）。

2.4 外周血细胞检测结果

与正常对照组比较，模型组WBC、LYMPH%有显著差异（P<0.05),NEUT%、RBC、HGB有极显著差异（P<0.01）；与模型组比较，乌苯美司组WBC、HGB存在显著差异（P<0.05),RBC、PLT有极显著差异（P<0.01),SPS高剂量组与模型组比较，WBC、RBC、HGB有极显著差异（P<0.01),PLT有显著差异（P<0.05),SPS低剂量组WBC、RBC与模型组比较，有极显著性差异（P<0.01),HGB有显著差异（P<0.05，表4）。

表3 血浆GST与MDA含量

表1 小鼠体质量结果

表2 免疫器官（胸腺、脾脏）指数结果

表4 各组外周血细胞分析结果

表5 各组小鼠外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞检测结果

图1 外周血T细胞分类检测

图2 胸腺组织HE染色结果

图3 胸腺组织TUNEL细胞凋亡检测（×100)

2.5 外周血T细胞分类检测结果

模型组较正常对照组CD3+CD4+T、CD3+CD8+T百分比及CD4+T/CD8+T下降，但差异无统计学意义（P>0.05);SPS高、低剂量组CD3+CD4+T百分比较模型组极显著升高（P<0.01),CD3+CD8+T百分比显著升高（P<0.05，表5、图1）。

2.6 胸腺HE染色

对照组胸腺皮质与髓质分界清晰，皮质区淋巴细胞排列有序，髓质区可见胸腺小体；模型组结构疏松，皮质分界较为模糊，细胞间隙增大，淋巴细胞减少；SPS高剂量组皮质与髓质分界较为清晰，细胞排列规整，淋巴细胞较多；SPS低剂量胸腺组织结构清晰，淋巴细胞数正常（图2）。

2.7 胸腺TUNEL细胞凋亡检测结果

正常对照组胸腺皮质、髓质中极少数细胞出现凋亡；模型组较正常组凋亡细胞明显增多，且皮质凋亡明显；乌苯美司组皮质凋亡较模型组略有减少；SPS高剂量组胸腺组织细胞凋亡较少；SPS低剂量组胸腺组织皮质与髓质均有较多细胞凋亡出现（图3）。

2.8 外周血TRECs含量检测结果

模型组TRECs表达较正常组显著减少（P<0.01），阳性药乌苯美司组较模型组极显著增加（P<0.01),SPS高剂量组较模型组显著增加（P<0.05),SPS低剂量组与模型组无显著差异（表6）。

表6 外周血TRECs相对表达

3、讨论

现代药理学研究表明，SPS可作为免疫调节剂用于免疫相关疾病治疗。如SPS可增强淋巴细胞转化，对抗强的松龙的免疫抑制作用，对免疫功能具有正向调节作用[10]；又可促进小鼠网状内皮系统吞噬功能，提高机体非特异性免疫功能[11];SPS可促进人外周血单个核细胞增殖，同时促进单核细胞IFN-γ、IL-2分泌[12]；也可与NK细胞联用产生协同效应杀伤肠癌细胞，具有抗肿瘤免疫调节作用[13]。作用机制方面，红花等中药所含多糖类成分可通过“IFN-IL-NKC”网络诱导IFN生成；通过调节细胞因子网络、T细胞网络及内分泌-免疫网络增强免疫功能[14]。因此，SPS作为免疫治疗剂具有较好的应用前景。

本研究表明，高、低剂量SPS均可显著提高小鼠胸腺指数、外周血白细胞数量、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞比例，胸腺HE染色显示SPS高、低剂量组较模型组皮质与髓质分界清晰，细胞排列规整，淋巴细胞较多；胸腺TUNEL细胞凋亡染色显示高剂量SPS可显著减少胸腺组织细胞凋亡；SPS高剂量组外周血TRECs含量较模型组有所提高，说明高剂量SPS可提高胸腺输出能力。

综上，SPS对苯甲酸雌二醇诱导的ICR小鼠胸腺萎缩有一定治疗作用，可显著改善胸腺萎缩症状，但针对其他病因诱导的胸腺萎缩模型（如聚肌胞苷酸、地塞米松诱导萎缩及自然衰老萎缩等）尚无研究，需进行更系统的药效评价明确其应用价值。

参考文献:

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基金资助:国家重点研发计划“中医药现代化”重点专项(2019YFC1710900);