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橘皮素缓解APP/PS1小鼠小胶质细胞过度激活及认知功能障碍

2024-06-18 34 上传者：管理员

摘要：目的观察橘皮素（tangeretin,TAN）对APP/PS1小鼠认知功能，以及脑内小胶质细胞过度激活和炎症因子分泌的影响。方法 2.5月龄雄性APP/PS1小鼠，通过口服给予TAN，连续干预16周，观察TAN对缓解APP/PS1认知功能障碍，以及脑内小胶质细胞过度激活和炎症因子分泌的作用。结果通过行为学检测发现TAN明显改善APP/PS1小鼠认知障碍；通过免疫荧光染色，发现TAN显著缓解APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞的过度激活；多因子分析检测发现，TAN显著升高小鼠脑内抑炎因子IL-2和IL-5的水平。结论 TAN显著减轻APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞过度激活以及调节炎症因子分泌，缓解小鼠的认知障碍。

关键词：
AD
小胶质细胞
橘皮素
炎症因子
阿尔兹海默症
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阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是常见的神经退行性疾病，主要发病人群为70岁以上的老年人[1]。由于全球人口老龄化，AD发病率逐渐增加，造成巨大的社会和经济负担。2018年，全球约有5 000万AD患者，而到2050年，AD的患病人数预计将增加两倍[2,3]。AD的主要病理特征是细胞外β-淀粉样斑块和细胞内过度磷酸化tau蛋白形成的神经纤维缠结[4,5]。除了上述两种AD特征性病理改变，脑内神经炎症和小胶质细胞过度激活近年来也被广泛研究。小胶质细胞为中枢神经系统内固有的免疫效应细胞，在稳态维护、损伤反应和病原体防御中发挥着极其重要的作用。随着AD病程的发展，过度激活的小胶质细胞表现为吞噬和降解功能障碍、产生高水平的活性氧和促炎因子，导致大脑的功能和结构损害。已有报道显示，小胶质细胞通过释放炎症因子和氧自由基促进β-淀粉样斑块的沉积。同时，过度激活的小胶质细胞还可促进tau蛋白的磷酸化。因此小胶质细胞功能紊乱与β-淀粉样斑块沉积与tau蛋白磷酸化密切相关，如何恢复小胶质细胞稳态是AD干预的新策略[6,7,8,9]。

目前，治疗AD的药物主要包括针对胆碱能和N-甲基-D-天门冬氨酸受体的药物，但这类药物的治疗效果有限。因此，有必要研发新的药物分子靶标和干预策略。橘皮素（tangeretin,TAN）是一种典型的多甲氧基黄酮，存在于甜橙（Citrus sinensis）和柑橘（Citrus reticulata）的果皮中。近年来，TAN的生物活性，包括抗炎、抗氧化、降血脂和神经保护活性已经被广泛地报道[10]。本研究发现TAN显著减轻AD模型小鼠的认知障碍，并缓解模型小鼠脑内小胶质细胞的过度激活，调节炎症因子IL-2和IL-5的水平，为TAN用于AD防治提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 实验动物

依据优化、减少、替代的3R原则进行实验设计的要求，将12只通过鼠尾鉴定阳性的雄性APPswe/PSEN1d E9(APP/PS1）转基因小鼠随机分成2组，其中，给药组每天灌胃100 mg/kg体重的橘皮素（n=6,TAN组），对照组每天灌胃等体积的2%羧甲基纤维素钠（n=6,Vehicle组），连续给药16周。所有小鼠都饲养在标准实验室条件下（12 h光/暗循环，湿度50%～70%，温度22～24℃），实验期间小鼠自由饮水饮食。动物操作按照江汉大学批准的机构动物护理和实验方案进行，所有动物实验均经江汉大学医学伦理委员会批准，批准号为JHDXLL2021-067。

1.2 实验药物和仪器

药物：橘皮素（CID:68077，纯度≥98%）购自成都普瑞法有限公司（中国，四川成都），灌胃前均匀分散在2%(m/v）羧甲基纤维素钠（Sigma，美国）溶液，现配现用。RIPA裂解液（碧云天，中国），4%的多聚甲醛（Biosharp，中国）。

仪器：VT100震荡切片机（Campden Instruments，英国），SP8激光共聚焦显微镜（莱卡，德国），水迷宫仪器以及配件（上海新软，中国）。

1.3 实验方法

1.3.1 水迷宫测试

给药完成后，所有小鼠进行6 d水迷宫检测，其中前5天是训练期，第6天是检测期。水迷宫测试设备由一个圆形水箱和平台组成。在5天的训练阶段，小鼠从不同象限放入水池，自由活动3 min，到达平台3 s后停止，记录小鼠到达水中平台的潜伏期时间和游泳速度。如果小鼠在3 min内未找到平台，引导其到达平台停留10 s。第6天检测阶段，撤掉平台，自由活动1 min，记录小鼠在平台象限停留的时间。所有行为学测试数据均使用Super Maze软件记录。

1.3.2 小胶质细胞形态分析

所有小鼠气体麻醉处死后，0.9%生理盐水灌注，一侧脑组织被取出放在冰上分离海马和皮层，另一侧脑组织浸入4%的多聚甲醛进行固定，震荡切片机切片，切片厚度20μm。免疫荧光染色时，将需要染色的脑片用PBS溶液清洗3次，然后用含有5%牛血清白蛋白的0.1%Triton X-100进行破膜封闭1h。用IBA1(ab178846,Abcam）一抗在4℃孵育过夜。第2天，回收一抗，用TBST溶液洗脑片3次，每次5 min，用荧光二抗Alexa Fluor 488(A21206,Invitrogen)37℃下孵育脑片1 h，回收二抗，再用TBST溶液洗脑片3次，每次5 min。最后用1%Hoechst常温染核10 min，用PBS洗脑片3次，每次5 min。用抗荧光猝灭剂封片，然后激光共聚焦显微镜观察并拍照[8]。拍照完成后，使用Imaris软件进行小胶质细胞的3D形态重建，用Image J软件进行图像处理和分析。

1.3.3 炎症因子检测

所有小鼠气体麻醉处死后，脑组织被取出放在冰上分离海马和皮层，用RIPA裂解液将组织匀浆并定量。小鼠脑中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70、IFN-γ、KC-GRO和TNF-α蛋白含量用电化学发光超敏多因子技术（Meso Scale Discovery,MSD）进行检测。具体操作是先将预先设置好的涂板用wash buffer清洗3次后，加入50μL匀浆好的组织，室温孵育2 h后，再次清洗3次，然后依次加入25μL待检测的抗体并室温孵育2 h。最后加入150μL read buffer，并用MSD检测仪（MD,USA）检测。

1.4 数据分析

所有统计分析均使用Prism 8进行。所有数据用均数±标准误（xˉ±sem）表示，水迷宫逃避潜伏期数据使用给药组与对照组数据采用重复测量的双因素方差分析、bonferroni检验，其余给药组与对照组数据采用非配对t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 橘皮素缓解APP/PS1小鼠的认知功能障碍

首先探究口服给药橘皮素对6.5月龄的APP/PS1小鼠认知功能的影响，如图1所示，和溶剂对照组相比，橘皮素给药组在Morris水迷宫前5天训练没有差异（见图1A）；而在第6天的空间探索实验中，橘皮素给药组穿越平台区域的次数显著增多（见图1B,(1.333 0±0.421 6)vs(0.333 3±0.210 8),P<0.05）。运动轨迹（见图1C）也显示，给药组小鼠穿越平台次数增多。Morris水迷宫表明TAN可显著改善APP/PS1小鼠认知功能。

图1 橘皮素显著改善APP/PS1小鼠的认知功能

2.2 橘皮素显著缓解APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞的过度激活

小胶质细胞是脑内最重要的先天免疫细胞，小胶质细胞功能紊乱与AD病理密切相关。为了探究橘皮素对APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞的影响，采用免疫荧光对两组小鼠的海马DG、CA1区和皮层均进行了染色，如图2A～图2F所示。结果表明，橘皮素干预显著缓解APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞的过度激活。给予橘皮素干预后，TAN组小鼠CA1区和皮层区小胶质细胞胞体体积显著变小（图2I,(615.5±27.41)vs(455.9±14.42),P<0.001，图2K,(405.5±15.36)vs(360.7±12.76),P<0.05），在DG区差异没有统计学意义（图2G,(259.7±13.300)vs(246.4±9.244））。TAN组小鼠在DG区小胶质细胞突起复杂程度显著变低（图2H,P<0.01），在CA1区和皮层区差异没有统计学意义（图2J，图2L）。以上结果表明，橘皮素显著缓解AD模型小鼠脑内小胶质细胞的过度激活。

2.3 橘皮素调节APP/PS1小鼠脑内炎症因子的分泌

为了探究TAN对APP/PS1小鼠脑内炎症因子的影响，分别检测了两组APP/PS1小鼠大脑海马和皮层的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70、IFN-γ、KC-GRO和TNF-α常见的炎性相关因子的水平如图3所示。图3结果表明，给予橘皮素干预后海马组织中的抑炎因子IL-2显著升高（图3A,(1.000±0.185 4)vs(1.942±0.243 3),P<0.05），而皮层组织中的抑炎因子IL-5显著升高（图3B,(1.000±0.067 81)vs(1.406±0.128 80),P<0.05）。总体来说，TAN显著改善APP/PS1小鼠脑内炎性水平。

3、讨论

小胶质细胞过度激活是阿尔茨海默病病理特征之一[11]。小胶质细胞为中枢神经系统内固有的免疫效应细胞，在中枢神经系统的稳态维护、损伤反应和病原体防御中发挥着极其重要的作用[12]。而病理状态下，过度激活的小胶质细胞表现为吞噬功能障碍、产生高水平的活性氧和促炎因子，在神经炎症以及AD功能损伤中发挥重要作用[13]。越来越多的证据表明，小胶质细胞过度激活和小胶质细胞对β-淀粉样蛋白的反应改变与AD风险增加有关[14]。同时也有大量研究[15,16,17]报道，激活的小胶质细胞损伤神经元，导致认知功能损伤。一方面激活的小胶质细胞可以通过补体依赖机制介导突触丢失[18]，另一方面激活的小胶质细胞可以加剧tau蛋白磷酸化并分泌炎症因子[19]，这些炎症因子可以直接或通过激活神经毒性星形胶质细胞损伤神经元，加重AD病理进程。全基因组关联研究[11]也发现许多AD相关基因位点在小胶质细胞中特异性或高表达，提示小胶质细胞功能紊乱与AD病变密切相关，可能是潜在的干预靶点。

橘皮素（TAN）是一种天然多甲基黄酮类化合物，是橘皮中的活性成分。橘皮素具有多种药理特性，包括抗炎症和抗氧化作用。橘皮素可通过调节NF-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB）通路抑制结肠炎和肾衰竭患者的炎症[20]，橘皮素也可以通过调节丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路减轻顺铂诱导的急性肝损伤[21]，并通过激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）保护胶原诱导的关节炎[22]。本课题组前期研究[10]发现TAN可以与BACE1结合抑制BACE1的活性，减少Aβ斑块积累从而逆转APP/PS1小鼠脑内突触损伤。然而，TAN对活化的小胶质细胞影响未见报道。本研究中用橘皮素通过口服给药的方式连续干预2.5月龄雄性APP/PS1小鼠16周，探讨TAN对APP/PS1小鼠脑内胶质细胞激活和炎症水平的影响。本研究发现给予TAN改变了APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞的炎性状态，抑制小胶质细胞的过度激活。并且炎症因子检测也发现，与对照组相比，给予TAN后海马组织中抑炎因子IL-2显著升高，皮层组织中的抑炎因子IL-5升高。这些研究表明，TAN具有改善APP/PS1小鼠脑内炎性的潜力。但是仍需要进一步的研究来明确TAN给药剂量以达到最优的治疗效果。

图2 橘皮素干预显著缓解APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞的过度激活

给予橘皮素干预后，APP/PS1小鼠的海马DG区（A和B）、CA1区（C和D）和皮层区（E和F）小胶质细胞免疫荧光染色示意图。TAN组小鼠CA1区和皮层区小胶质细胞胞体体积显著变小（I和K），在DG区没有显著差异（G）。TAN组小鼠在CA1区小胶质细胞突起复杂程度显著变低（J），在DG区和皮层区没有显著差异（H,I和K中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）。

图3 橘皮素干预显著升高APP/PS1小鼠脑内抑炎因子IL-2和IL-5的水平

橘皮素干预引起了APP/PS1小鼠脑内海马及皮层炎症因子水平变化。给予橘皮素干预后：A.海马组织中的抑炎因子IL-2显著升高；B.皮层组织中抑炎因子的IL-5显著升高（A和B中，*表示P<0.05）。

参考文献:

[2]任汝静,殷鹏,王志会,等.中国阿尔茨海默病报告2021[J].诊断学理论与实践,2021,20(4):317-337.

[5]汪睿彤,刘珏.阿尔茨海默病的流行病学研究进展[J].中国慢性病预防与控制,2021,29(9):707-711.

基金资助:湖北省自然科学基金面上项目(2022CFB456);

文章来源:于晶,梁征,贺子珊,等.橘皮素缓解APP/PS1小鼠小胶质细胞过度激活及认知功能障碍[J].江汉大学学报(自然科学版),2024,52(03):44-50.