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蟾毒灵通过JAK2/STAT3信号通路抑制结直肠癌细胞的作用

2024-07-09 56 上传者：管理员

摘要：目的探索蟾毒灵通过Janus激酶2(JAK2)/信号转导子和转录激活子3(STAT3)通路抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭的机制研究。方法将人结直肠癌HT29细胞随机分为对照组和低、中、高剂量实验组；对照组细胞不做处理，低、中、高剂量实验组细胞分别给予2.5、5.0、10.0μmol·L-1的蟾毒灵处理48 h。用FLAG STAT3慢病毒感染HT29细胞后，细胞分为慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染(10.0μmol·L-1)组。用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率；用克隆实验验证细胞增殖率；用Transwell实验验证蟾毒灵作用后细胞的迁移能力；用蛋白质印迹(Western blot)法检测慢病毒转染效率以及细胞相关蛋白表达情况。结果药物作用48 h后，对照组和低、中、高剂量实验组细胞数分别为(1 003.25±255.53)、(698.00±152.25)、(562.13±31.56)和(449.50±82.40)个，侵袭细胞数分别为(932.00±188.84)、(742.22±108.64)、(514.67±124.82)和(343.56±86.42)个，p-JAK2蛋白相对表达水平分别为1.37±0.27、0.97±0.06、0.74±0.06和0.39±0.12;对照组、高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞数分别为(906.88±211.71)、(389.00±143.08)、(1 279.38±210.34)和(604.75±12.52)个，侵袭细胞分别为(671.22±44.74)、(246.11±28.16)、(1 080.78±119.13)和(574.78±16.23)个。中、高剂量实验组的细胞增殖数量、细胞侵袭数量和p-JAK2蛋白相对水平与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞增殖数量、细胞侵袭数量与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论蟾毒灵可通过激活JAK2/STAT3信号通路抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭。

关键词：
Janus激酶2(JAK2)
人结直肠癌细胞
信号转导子和转录激活子3(STAT3)信号通路
细胞增殖
蟾毒灵
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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤，随着社会压力和生活水平的不断提高，年轻人中患有CRC的比例逐渐增加[1]。目前，CRC临床主要的治疗方法有手术治疗、放疗、化疗，但疗效有限，预后差，且复发率高，严重影响患者术后生存质量[2]。随着中国传统医药的不断发展和经验积累，中医防治CRC在临床优势不断凸显。蟾酥是我国传统中医药，被广泛用于抗肿瘤，研究表明，提取自蟾酥的多羟基甾体化合物蟾毒灵具有抗肿瘤、抑制肿瘤转移的作用[3]。Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号的异常激活在CRC表达明显[4]。本研究旨在探究蟾毒灵抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭能力及其作用机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞株人结直肠癌细胞系(HT-29),购自美国ATCC。

药品与试剂蟾毒灵，规格：每瓶1 g, 纯度：98%,批号：465-21-4,购自成都瑞芬思生物科技有限公司。STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)、JAK2、磷酸化JAK2(phosphorylated JAK2, p-JAK2)一抗，均由美国Cell Signaling Technology公司生产。慢病毒，由和元生物设计构建。

仪器680型多功能酶标仪，美国BioRad公司产品； Dmi1型倒置显微镜、DMIL型倒置显微镜，均为德国Leica公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[5]5]

将HT-29结直肠癌细胞培养在的RPMI-1640培养基(含有10%胎牛血清)中，并置于恒温培养箱中培养(温度为37 ℃,CO2浓度为5%,培养箱湿度为70%～80%),每天观察细胞生长情况，待细胞融合至80%左右时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.2 慢病毒转染[6]6]

HT29细胞消化后记数，将细胞悬液调整为1×105 cell·mL-1,24孔板中每孔加入细胞悬液500 μL,培养24 h等待细胞贴壁。按照说明书设置不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI)组，设置MOI为0、10、20、40、80 TU·cell-1,同时设置加含5 μg·mL-1 Polybrene的培养基实验组，对照组为不处理的细胞组，观察细胞生长状态。慢病毒感染12～16 h后进行换液，去除实验组中的培养基，更换为新鲜的培养基。72 h后在荧光显微镜下观察，确定适合的MOI。

2.3 细胞分组与处置方法

将HT-29细胞分为对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、慢病毒转染组、高剂量实验+慢病毒感染组。对照组和实验组均不进行转染；慢病毒转染组用FLAG STAT3慢病毒转染16 h; 低、中、高剂量实验组在对照组的基础上分别予以2.5、5.0和10.0 μmol·L-1蟾毒灵处理；高剂量实验+慢病毒转染组用FLAG STAT3慢病毒转染16 h后用10.0 μmol·L-1蟾毒灵处理。

2.4 CCK-8实验检测细胞活性

用不同浓度(0、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00和400.00 μmol·L-1)的蟾毒灵(二甲基亚砜溶解)处理细胞48 h, 用CCK-8实验检测各浓度处理后的细胞存活率并筛选后续蟾毒灵实验剂量。

2.5 蛋白质印迹(Western blot) 法检测蛋白相对表达水平

按“2.3”分组处理方法处理48 h后的细胞，用磷酸盐缓冲液冲洗，冰上充分裂解后，在4 ℃离心后取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒定量，参考文献[5]方法进行凝胶电泳，凝胶成像系统曝光检测，用Image J软件对Western blot结果进行定量分析。

2.6 Transwell 实验检测细胞侵袭

在Transwell小室的底膜用基质胶铺底后，置入Transwell专用24孔板中。将处理后的细胞分别与无血清培养基300 μL混合后加入小室内；之后向小室下的孔中加入含10%胎牛血清培养基700 μL。共培养48 h后，弃去培养基，用甲醇将膜表面的细胞固定，用结晶紫染色后，将小室晾干，在显微镜下拍照，在光学显微镜下计数细胞。

2.7 克隆形成实验实验检测细胞增殖

细胞以1.5×104 cell·mL-1的密度接种于6孔板中每孔200 μL,24 h细胞贴壁后，加入含药培养基48 h后换正常培养基，培养7～14 d, 定期换新的培养液，培养结束后加入结晶紫染色观察细胞集落的形成情况。

2.8 划痕实验检测细胞迁移

细胞以5×105 cell·mL-1的密度接种于6孔板中，每孔200 μL,24 h细胞贴壁后，用200 μL枪头划痕，划痕后用磷酸盐缓冲液清洗，置于显微镜下拍照，标记拍照位置，加入含药无血清的RPMI-1640培养24 h后，置于显微镜下于同一位置拍照，计算划痕愈合率。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以

表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 蟾毒灵对HT29细胞活力的影响

蟾毒灵作用HT-29细胞24 h的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值为(269.52±56.91)μmol·L-1,48 h的IC50值为(71.17±12.76)μmol·L-1。选择低于IC50的3个浓度作为后续实验给药浓度，分别为2.5、5.0和10.0 μmol·L-1,药物作用时间为48 h。

2 蟾毒灵对HT29细胞复制能力的影响

对照组、低剂量实验组、中剂量实验组和高剂量实验组细胞数分别为(1 003.25±255.53)、(698.00±152.25)、(562.13±31.56)和(449.50±82.40)个，低、中和高剂量实验组的增殖细胞数量与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

3 蟾毒灵对HT29细胞侵袭能力的影响

对照组、低剂量实验组、中剂量实验组和高剂量实验组侵袭细胞分别为(932.00±188.84)、(742.22±108.64)、(514.67±124.82)和(343.56±86.42)个，中剂量实验组和高剂量实验组的细胞迁移和侵袭细胞数量与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

4 蟾毒灵对HT29细胞迁移能力的影响

对照组、低剂量实验组、中剂量实验组和高剂量实验组细胞迁移面积百分比分别为(58.08±0.75)%、(43.10±5.60)%、(36.58±0.48)%和(14.62±4.38)%,低剂量实验组、中剂量实验组和高剂量实验组细胞的迁移面积与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

5 蟾毒灵对HT29细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3相关通路的影响

对照组、低剂量实验组、中剂量实验组和高剂量实验组p-JAK2蛋白相对表达水平分别为1.37±0.27、0.97±0.06、0.74±0.06和0.39±0.12,p-STAT3蛋白相对表达水平为1.67±0.24、1.30±0.26、0.66±0.39和0.31±0.14。低、中、高剂量实验组的p-JAK2、p-STAT3蛋白相对水平与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1。

6 蟾毒灵对HT29 STAT3 FALG细胞克隆形成能力的影响

结果见图2。对照组、高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞克隆数分别为(906.88±211.71)、(389.00±143.08)、(1 279.38±210.34)和(604.75±12.52)个，高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组与对照组比较，慢病毒感染组与高剂量实验+慢病毒感染组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图1 蟾毒灵对HT29细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3相关通路的影响

图2 克隆实验验证蟾毒灵对HT29 STAT3 FALG细胞克隆形成能力的影响

7 蟾毒灵对HT29 STAT3 FALG细胞侵袭能力的影响

对照组、高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组侵袭细胞分别为(671.22±44.74)、(246.11±28.16)、(1 080.78±119.13)和(574.78±16.23)个，高剂量实验组和慢病毒感染组与对照组比较，高剂量实验+慢病毒感染组与慢病毒感染组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

8 蟾毒灵对HT29 FLAG STAT3细胞迁移能力的影响

对照组、高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞迁移后面积百分比分别为(60.71±0.70)%、(12.76±3.08)%、(72.14±3.03)%和(37.33±3.33)%,高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组与对照组比较，慢病毒感染组与高剂量实验+慢病毒感染组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

三、讨论

CRC是常见的肿瘤之一，近年来随着我国人口老龄化逐渐上升，CRC患病率逐渐提升。从中医角度来说，晚期CRC多属于肝肾阴虚、湿热瘀毒证，患者生存质量和一年生存率较低[7]。中药具有多成分、多靶点的治疗作用[8]。蟾酥是中华传统中医药医药，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺和皮肤腺体的干燥分泌物，具有解毒、消肿、强心、止痛的功效。蟾酥治疗CRC属于中医理念中的对症治疗，其单体蟾毒灵在多种肿瘤中也具有强大的抗肿瘤作用[9,10,11]。

STAT3是一种细胞质转录因子，调节细胞的增殖、分化、凋亡、血管生成、炎症和免疫反应。在许多人类癌症中，STAT3的异常激活通过致癌基因的表达触发肿瘤的进展，导致肿瘤的恶性进展[12,13]。已有研究证明，在CRC中JAK2/STAT3信号通路促进CRC细胞的恶性进展[14]。研究发现，JAK2/STAT3的表达在癌症患者中，与CRC的表达更具有相关性，课题组前期研究证明，蟾毒灵能抑制结肠癌细胞侵袭和转移，并且能够通过抑制STAT3信号通路介导的血管生成抑制CRC的进展[15]。

本实验以CRC细胞HT29为研究对象，体外实验证实蟾毒灵可抑制CRC细胞增殖、侵袭与迁移。本实验研究发现，蟾毒灵处理CRC细胞后，CRC细胞增殖、侵袭和迁移能力显著减弱，且细胞中JAK2,STAT3蛋白磷酸化水平显著减少，对JAK2和STAT3总蛋白的影响较为微弱，说明蟾毒灵能够抑制JAK2/STAT3的磷酸化水平，进而抑制细胞的增殖、侵袭与迁移。为了验证蟾毒灵是否通过抑制STAT3信号通路发挥作用，本研究通过慢病毒对HT29细胞进行感染，并运用Western blot实验对转染效率进行验证，细胞中STAT3蛋白表达明显升高，证明慢病毒转染成功。进一步研究发现，慢病毒过表达STAT3的HT29细胞可促进结肠癌细胞的增殖、侵袭与迁移，并减弱蟾毒灵的抑制作用，这表明蟾毒灵可通过介导JAK2/STAT3通路抑制细胞增殖、侵袭与迁移发挥抗癌功效。

本实验研究证明，蟾毒灵能有效地抑制HT29细胞增殖、侵袭与迁移，从而发挥抗CRC的作用，而该作用在一定程度上是通过抑制JAK2/STAT3的磷酸化水平来实现的。本研究结果为蟾毒灵用于CRC临床治疗提供了一定的理论依据，并丰富了蟾毒灵抗CRC的机制。

参考文献:

[3]毛发江,黄海燕,左玲.蟾毒灵抗肿瘤作用机制的研究进展 [J].上海中医药杂志,2022,56(2):87—90.

[5]尚靖,李宗恒,夏琪,等.蟾毒灵通过激活内质网应激通路诱导HCT116细胞凋亡 [J].安徽医科大学学报,2023,58(2):274—279.

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[10]陈进宝,贾琳琳,吴文韬,等.蟾毒灵通过抑制M2型巨噬细胞极化抗结肠癌细胞耐药与上皮间质转化[J].中国新药与临床杂志,2023,42(11):744—749.

[11]邱文艳,陈思雅,颜红,等.蟾毒灵抗肝肿瘤活性及靶向载药系统研究进展 [J].湖南中医杂志,2023,39(5):189—193.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81973700,81873137); 上海中医药大学重大成果培育计划基金资助项目(2021DX001);上海中医药大学科技发展基金资助项目(23KFL084);

文章来源:夏琪,陈佳,何钰洁,等.蟾毒灵通过JAK2/STAT3信号通路抑制结直肠癌细胞的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1883-1887.