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橙皮苷促进小鼠急性皮肤创面愈合的作用研究

2024-07-22 26 上传者：管理员

摘要：目的研究橙皮苷对人角质形成细胞（HaCaT）和人皮肤成纤维细胞（HSF）迁移能力的影响，初步探索橙皮苷促进小鼠急性皮肤创面愈合的作用及相关机制。方法将HaCaT和HSF分为空白组（不做任何处理）、对照组（加入0.1%二甲基亚砜）和实验组(加入5.0μg·mL-1的橙皮苷),培养48 h。用细胞划痕实验检测细胞体外愈合能力，用Transwell迁移实验检测细胞迁移情况。将C57小鼠随机分为模型组和低、高剂量实验组，用手术剪剪下小鼠背部全层皮肤建立急性皮肤全层缺损创面模型。模型组给予0.5%二甲基亚砜，低、高剂量实验组分别给予10、50 mg·kg-1 橙皮苷溶液。用蛋白质印迹法检测β-连环蛋白、增殖细胞核抗原（PCNA）、角蛋白14、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果 HaCaT-空白组、HaCaT-对照组和HaCaT-实验组的划痕愈合率分别为（21.05±1.10）%、（22.33±1.72）%、（41.61±2.90）%,细胞迁移数分别为（57.00±11.36）、（60.38±10.11）、（287.75±20.21）个；HSF-空白组、HSF-对照组和HSF-实验组的划痕愈合率分别为（17.82±1.62）%、（19.81±3.87）%、（64.22±1.94）%,细胞迁移数分别为（43.25±7.98）、（40.75±6.70）、（140.88±14.35）个。HaCaT-实验组的上述指标与HaCaT-空白组、HaCaT-对照组比较，HSF-实验组的上述指标与HSF-空白组、HSF-对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。模型组和低、高剂量实验组β-连环蛋白表达水平分别为0.53±0.06、0.74±0.17和1.44±0.11,角蛋白14相对表达水平分别为0.33±0.06、0.54±0.07和1.26±0.16,PCNA相对表达水平分别为0.46±0.05、0.72±0.09和1.14±0.11,Ⅰ型胶原蛋白相对表达水平分别为0.52±0.03、0.77±0.05和1.28±0.13。低、高剂量实验组的上述指标与模型组相比，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结论橙皮苷可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，增加HaCaT和HSF的迁移，促进小鼠急性皮肤创面愈合。

关键词：
Wnt/β-catenin
人皮肤成纤维细胞
人角质形成细胞
创面愈合
橙皮苷
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创面愈合是一个重要的生理过程，可以维持创伤后皮肤的完整性[1]。橙皮苷是一种生物类黄酮，来源广泛，具有抗炎、抗氧化、抗癌、保护神经系统和心血管系统等作用[2]。橙皮苷能通过激活Wnt/β-catenin通路促进人牙槽成骨细胞分化[3]。Wnt/β-catenin信号通路在伤口愈合过程中起着重要的作用[4]。本研究旨在通过体内和体外实验去探究橙皮苷对急性创面愈合的作用，为治疗急性皮肤创伤提供新的思路。

一、材料与方法

1 材料

细胞人角质形成细胞(human keratinocytes, HaCaT)和人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast, HSF),均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

动物45只 C57小鼠，鼠龄8周，体质量18～22 g, 购于维通利华实验动物技术有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0006。本研究经温州医科大学实验动物伦理委员会批准(伦理批号：Wydw2023-0296)。

药品与试剂橙皮苷标准品，规格：每瓶5 g, 含量：≥98%,由大连美仑生物有限公司生产。β-catenin抗体，购于美国Signaling公司；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、角蛋白14(keratin 14)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)抗体，均购于英国Abcam公司；辣根过氧化物酶偶联二抗，购于杭州联科生物公司。细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒，购自苏州新赛美生物有限公司。

仪器InFinite M200全波长扫描多功能酶标仪，瑞士TECAN集团公司产品；KF-PRO-005全自动数字病理扫描仪，江丰生物信息有限公司产品；CFX96touch荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞实验

2.1.1 细胞培养[5]

HaCaT/HSF在含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的MEM/RPMI培养基中于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每隔2 d更换1次培养基。显微镜观察细胞长到90%左右开始传代或进行后续实验。

2.1.2 CCK-8法检测HaCaT和HSF的细胞活力[6]

调整细胞密度为5×10-4cell·mL-1,接种于96孔板中，每组设置8个复孔，培养12 h。分别加入0、1、5、10、50 μg·mL-1的橙皮苷溶液处理细胞。继续培养48 h后弃上清液。更换新的培养基后，每孔加入CCK-8溶液10 μL,于37 ℃环境中孵育1 h。用酶标仪在450 nm处测光密度值并计算细胞存活率。

2.1.3 药物处理与分组

通过“2.1.2”筛选出合适的橙皮苷浓度作为实验组给药浓度。将对数生长期的HaCaT随机分为HaCaT-空白组、HaCaT-对照组和HaCaT-实验组。HSF随机分为HSF-空白组、HSF-对照组和HSF-实验组。以上空白组不做任何处理，对照组用等体积的0.1%二甲基亚砜溶液处理细胞48 h, 实验组用5.0 μg·mL-1橙皮苷处理细胞48 h。

2.1.4 划痕实验法检测细胞的划痕愈合能力[7]

细胞以5×105cell·mL-1的密度接种到12孔板中。待细胞融合度达到90%以上时，用移液枪头尖端在孔板中间划痕。按“2.1.3”分组和方法处理细胞48 h。分别于0、48 h拍照。用Image J软件测量0、48 h的划痕面积，计算细胞划痕愈合率。

2.1.5 Transwell迁移实验法检测细胞的迁移能力[8]

细胞以2×105cell·mL-1接种于Transwell上室中，按“2.1.3”进行分组和处理，Transwell上下室添加无血清培养基，培养24 h。取出Transwell上室，用4%的多聚甲醛固定10 min。然后用0.1%的结晶紫染色。用棉签轻轻擦掉上室内侧的细胞。用病理扫描仪扫描拍照观察细胞迁移情况。用Image J软件统计迁移细胞个数。

2.2 动物实验

2.2.1 模型构建和动物分组及给药方法[9]

将45只小鼠随机分为3组，每组15只，依次为模型组和低、高剂量实验组。

小鼠腹腔注射2%的戊巴比妥钠麻醉小鼠后，剃除背部毛发，用记号笔在小鼠的背上画出直径1 cm的圆，用镊子提起皮肤，用手术剪小心沿着标记剪下全层皮肤(表皮+真皮+皮下组织)制成小鼠皮肤全层缺损创面模型。

模型组给予0.5%二甲基亚砜溶液，低、高剂量实验组分别给予10、50 mg·kg-1的橙皮苷溶液。每天固定时间于创面处滴注给药1次，并于1、4、7、11、14 d进行伤口拍照记录，用Image J软件统计伤口面积。第14天处死小鼠，取创面皮肤组织作为后期检测样本。

2.2.2 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法观察皮肤创面组织病理状况[10]

取第14天伤口部位的皮肤组织于4%多聚甲醛中固定。将组织在浓度从低到高的梯度乙醇中脱水后置于二甲苯中透明，再用石蜡浸渍。用石蜡包埋后，切成厚度为5 μm的切片，用HE染色后封片，于病理扫描仪中扫描拍照。

2.2.3 蛋白质印迹法检测β-catenin、keratin 14、PCNA、collagen Ⅰ蛋白表达水平[11]

组织剪碎匀浆后加入含蛋白酶抑制药的细胞裂解液裂解30 min。根据BCA蛋白浓度试剂盒测定组织蛋白浓度，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳以分离蛋白，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%的脱脂奶粉封闭2 h后与相应的一抗在4 ℃下孵育过夜。用辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育2 h。蛋白质条带在化学发光成像仪上曝光。

2.2.4 实时荧光定量PCR法检测β-catenin、keratin 14、PCNA、collagen Ⅰ mRNA表达水平[12]

将皮肤组织剪碎后充分裂解，提取总RNA,合成cDNA。根据基因库里的序列，设计相关基因mRNA表达扩增引物。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为mRNA的内参，计算目的基因的相对表达水平。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。计量资料用

表示。2组间比较用两独立样本t检验；多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 细胞实验结果

1.1 CCK-8探测橙皮苷处理后的细胞活力及筛选合适药物浓度

用0、1、5、10、50 μg·mL-1的橙皮苷处理HaCaT或HSF 48 h后，HaCaT存活率分别为(100.00±2.19)%、(115.45±5.21)%、(121.08±2.41)%、(112.64±3.80)%和(107.34±2.86)%。与0 μg·mL-1比较，5 μg·mL-1橙皮苷处理后HaCaT细胞存活率具有显著性差异(P<0.05)。HSF存活率分别为(100.00±2.80)%、(122.84±1.84)%、(128.77±2.75)%、(119.22±4.66)%和(109.90±2.63)%。与0 μg·mL-1比较，1、5 μg·mL-1橙皮苷处理后HSF细胞存活率在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),其中5 μg·mL-1差异性更显著(P<0.01)。故本实验选择5 μg·mL-1作为后期实验的药物浓度。该结果也显示当药物浓度达到50 μg·mL-1时，并未出现显著的细胞毒性。

1.2 HaCaT体外划痕愈合和细胞迁移情况的比较

空白组不做任何处理，对照组用0.1%二甲基亚砜溶液处理细胞48 h, 实验组用5.0 μg·mL-1橙皮苷处理细胞48 h。

HaCaT-空白组、HaCaT-对照组和HaCaT-实验组的划痕愈合率分别为(21.05±1.10)%、(22.33±1.72)%、(41.61±2.90)%,HaCaT-实验组的划痕愈合率与HaCaT-空白组和HaCaT-对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。HaCaT-空白组、HaCaT-对照组和HaCaT-实验组的细胞迁移数分别为(57.00±11.36)、(60.38±10.11)、(287.75±20.21)个，HaCaT-实验组的细胞迁移数与HaCaT-空白组和HaCaT-对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1A。

1.3 3组HSF体外划痕愈合情况和细胞迁移情况的比较

HSF-空白组、HSF-对照组和HSF-实验组的划痕愈合率分别为(17.82±1.62)%、(19.81±3.87)%、(64.22±1.94)%,HSF-实验组的划痕愈合率与HSF-空白组和HSF-对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。HSF-空白组、HSF-对照组和HSF-实验组的细胞迁移数分别为(43.25±7.98)、(40.75±6.70)、(140.88±14.35)个，HSF-实验组的细胞迁移数与HSF-空白组和HSF-对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1B。

2 动物实验结果

2.1 小鼠急性创面愈合情况及HE染色

模型组给予0.5%二甲基亚砜溶液，低、高剂量组分别给予10、50 mg·kg-1的橙皮苷溶液。

与模型组比较，低、高剂量实验组创面愈合率更大，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结果见图2A。HE染色结果显示：第14天的伤口间隙形成了丰富的肉芽组织，高剂量实验组毛囊等附属器官数量远多于其他组，其次是低剂量实验组，模型组的表皮位置还有结痂，几乎未产生毛囊等附属器官。结果见图2B。

2.2 橙皮苷对β-catenin及相关伤口愈合标志物mRNA和蛋白的表达影响

低剂量和高剂量实验组与模型组比较，β-catenin、keratin 14、PCNA、collagen Ⅰ的mRNA表达水平和蛋白表达水平均呈剂量依赖性增加，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.001),见表1。

图1HaCaT(A)和HSF(B)细胞迁移情况的比较(×200)

图2小鼠创面相对愈合率(A)和第14天小鼠创面皮肤苏木精-伊红(HE)染色图(B;×100)

表1各组小鼠皮肤组织β-连环蛋白及相关伤口愈合标志物的mRNA和蛋白表达水平的比较

三、讨论

皮肤创面愈合过程涉及多种类型细胞相互协调，其中HaCaT和HSF在创面愈合中扮演着重要的角色，其对于维持皮肤稳态和伤口愈合至关重要。HaCaT 具有募集、刺激和协调多种细胞类型的作用，参与皮肤表皮屏障的建设，同时还分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板衍生因子(platelet derived growth factor, PDGF)诱导伤口床内皮细胞的迁移和血管生成[13]。HSF通过迁移、转化为肌成纤维以及形成新的肉芽组织来达到伤口收缩目的。HSF不仅负责合成胶原蛋白，同时还形成伤口闭合所必需的其他细胞外基质成分，并且能分泌不同的细胞因子如VEGF、PDGF、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)和碱性成纤维细胞生长因子，其对细胞增殖和新血管形成及伤口修复至关重要[14]。

皮肤再生所涉及的重要信号通路包括TGF-β通路、Notch通路、Hedgehog通路和Wnt/β-catenin通路，其中Wnt/β-catenin通路诱导多种细胞因子如collagen Ⅰ、keratin 14、VEGF和表皮生长因子等参与伤口愈合[5]。故Wnt/β-catenin途径是开发伤口愈合药的一个理想靶点。

本研究通过体内和体外研究探索了橙皮苷对创面愈合的作用。橙皮苷促进了HaCaT和HSF的迁移，加速小鼠皮肤急性创面再上皮化，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法结果均显示实验组中的β-catenin和其他伤口愈合标志物keratin14、PCNA、collagenⅠ 的mRNA和蛋白表达水平呈剂量依赖性增加。

文章来源:黄乙明,陈飞飞,张蓉蓉,等.橙皮苷促进小鼠急性皮肤创面愈合的作用研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(14):2093-2097.