类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以滑膜炎、血管翳形成及关节软骨和骨破坏为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病，严重影响人类的身体健康和生活质量[1]。RA全球发病率为0.5%～1%[2]，我国发病率约0.42%，男女患病率为1:4[3]。临床常用治疗RA的药物包括免疫抑制剂、生物制剂、抗风湿药、糖皮质激素及非甾体抗炎药。早期、规范、联合使用抗风湿药及生物制剂，能够阻止病情发展、减缓致残致畸风险，但长期使用抗风湿药物治疗产生诸多不良反应（心脑损害、肝肾损害及胃肠道不良反应），且生物制剂经济负担重[4]。因此，寻求安全有效的替代疗法是亟待解决的问题之一。

现代研究[5]发现RA骨破坏由免疫系统紊乱引起的滑膜炎导致破骨细胞活化，活化的破骨细胞引起骨破坏和骨质疏松症。当免疫系统受损时，滑膜细胞表达核因子κB配体的受体激活剂（RANKL）并产生蛋白酶，分别诱导骨破坏和软骨破坏。中医药治疗RA历史悠久，形成了中医特色诊疗体系，临床疗效明确[6]。祖师麻又名祖司麻、大救驾、走司麻等，味辛、苦，性温，具有祛风除湿，活血止痛之功效，临床常用于风寒湿痹、瘀血痹阻之证[7]。文献[8-9]报道祖师麻具有抗炎、镇痛等作用，主要作用于免疫系统疾病，可以通过改善脂质代谢进一步改善RA疾病诱发心血管并发症。另外，研究显示[10]祖师麻能够通过下调佐剂型关节炎大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α）、白介素-1β(IL-1β）因子的表达，上调滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）和巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的表达，发挥抗炎、抗骨破坏的作用，进而改善佐剂型大鼠关节炎症状，发挥疗效。祖师麻膏药由祖师麻提取精制的浸膏粉和武威膏药组成，课题组前期研究表明[11]祖师麻膏药能够缓解RA患者腕关节肿胀、疼痛及活动受限，临床疗效显著，但对RA炎症反应和骨破坏机制尚未明确。因此，本实验通过建立CIA小鼠模型，探讨祖师麻膏药对RA炎症反应及骨破坏的作用机制，以期为祖师麻治疗RA提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

24只SPF级雄性DBA/1小鼠，7～8周龄，体质量（20±2)g，购于常州卡文斯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2021-0013。定期予以食物和水喂养，分笼饲养于兰州大学SPF级动物房，室温为22～26℃，12 h/12 h明暗交替循环。本研究方案已通过兰州大学实验动物中心伦理委员会审核，实验遵循2006年科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2药物

祖师麻膏药购自甘肃泰康制药有限公司，批号Z62020522；扶他林（双氯芬酸二乙胺乳胶剂）购自北京诺华制药有限公司，批号H20020176。

1.3主要试剂及仪器

牛II型胶原（Chondrex公司）、弗氏不完全佐剂（Chondrex公司），弗氏完全佐剂（Sigma公司），IL-17、IL-1β、TNF-α、GAPDH抗体（艾科瑞），PCR试剂盒（美国Abcam），伊红、苏木素染液（Servicebio公司）

载玻片（陕西依科），盖玻片（江苏世泰），正置显微镜、成像系统（日本尼康），脱水机、包埋机（俊杰电子有限公司），病理切片机（上海徕卡），匀浆机（蚁博士），SCANCO Micro CT（瑞士苏黎世），高通量组织研磨器（宁波新芝），微量核酸测定仪（德国Eppendorf），基因扩增仪（杭州博日），荧光定量PCR仪（Roche公司）

1.4造模方法[12]

首次免疫时将2 mg/m L的牛II型胶原与等体积的弗氏完全佐剂在冰面上使用匀浆器充分搅拌混匀，完全混合、乳化，于小鼠尾根部2 cm处皮下注射100µL胶原乳剂；第21天时将牛II型胶原溶液与等体积的弗氏不完全佐剂充分混匀、乳化，方法同首次免疫。

1.5分组与给药

将DBA/1小鼠随机分为4组：正常组、模型组、膏药组和扶他林组，每组6只，各给药组给药剂量依据药理实验方法学[13]进行动物与人类等效剂量的换算获取，其中膏药组用药剂量依据人与动物公斤体重剂量换算法，扶他林组用药剂量依据体表面积直接计算法。浓度选择临床常用浓度予以干预，本研究小鼠用药剂量是临床人常用剂量的10倍[14]。第28天开始，各组小鼠分别予以干预。

正常组、模型组：于小鼠双膝、踝关节涂抹生理盐水，同时贴敷透气胶纸。祖师麻膏药组（膏药组）：按照人临床常用量7 g/次[11]，计算本次实验小鼠用药剂量为1.0 g/kg，加热后均匀涂抹于透气胶纸上，再行敷贴至双膝、踝关节。阳性对照组（扶他林组）：在实验前对小鼠的膝关节、踝关节进行脱毛，脱毛范围约为4 cm2。剂量为0.03 g/cm2×4 cm2=0.12 g/次，均匀涂抹于小鼠双膝、踝关节，同时贴敷透气胶纸。给药期间为防止膏药脱落，将小鼠装至带有透气孔的50 m L离心管中固定。各组于初次免疫后第28天开始干预，给药时间为每日上午08:00—12:00，连续4周。

1.6观察指标及检测方法

关节炎指数（arthritis index,AI）评分[14]：实验第22天开始用游标卡尺按照关节炎评分标准测量小鼠后爪并评分。评分标准：0分为正常；1分为爪子只红不肿/腕踝关节轻度红肿/指趾关节红肿明显；2分为腕踝关节中度红肿；3分为整个爪子包括指趾关节红肿；4分为多关节红肿甚至出现畸形。单只小鼠评分：（0～4）分×4爪=（0～16）分。以AI>4分表示造模成功。

Micro-CT观察小鼠后爪损伤情况：将固定于4%多聚甲醛中的小鼠后爪取出，采用瑞士苏黎世Micro CT仪器对各组小鼠后爪扫描拍照，通过Avizo2019软件对照片进行分析。

实时荧光PCR法检测小鼠踝关节组织中IL-17、IL-1β、TNF-α m RNA表达：取小鼠踝关节组织，使用离心柱法提取组织总RNA，按照PCR试剂盒转化为c DNA，进行扩增（反应体系为20μL）。反应条件为：95℃、30 s，循环1次；95℃、5 s,65℃，30 s，循环45次。以GAPDH为内参，采用2-∆∆Ct法计算目的基金的表达量。引物序列见Tab.1。

免疫组织化学法检测小鼠踝关节组织中OPG、RANKL蛋白的表达：将固定于4%多聚甲醛中的滑膜组织取出，石蜡包埋、切片（约4μm），脱水后用柠檬酸钠进行抗原热修复，后用3%H2O2孵育切片，加一抗4℃孵育过夜，次日加二抗37℃孵育2 h，用DBA法显色，封片，显微镜观察拍照，显示棕色为阳性表达，采集图像后用Image pro plus 6.0软件分析数据。

滑膜组织HE染色：将固定于4%多聚甲醛中的滑膜组织取出，切取组织块（约为0.5 cm），经过脱水、包埋、切片，行HE染色，显微镜观察病理变化。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）法观察踝关节组织破骨细胞数量：按照抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒进行操作，将固定于4%多聚甲醛中的踝关节组织取出，进行脱钙、包埋、切片、封片、烘干，将切片置于显微镜下观察破骨细胞并计数。

1.7统计学方法

所有数据采用SPSS 25.0软件分析，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐性用LSD检验，方差不齐用秩和检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1祖师麻膏药对CIA小鼠关节炎症状及评分的影响

干预结束后，正常组小鼠关节无变化。与正常组比较，模型组小鼠关节发红、肿胀明显；与模型组比较，膏药组和扶他林组红肿症状明显改善。干预结束后，与正常组比较，模型组小鼠在第28天开始，关节炎指数持续增加，第42天达到高峰；与模型组比较，膏药组和扶他林组在第40天关节炎指数开始降低，第56天降到最低，见Fig.1。

2.2祖师麻膏药对CIA小鼠膝关节滑膜组织中IL-17、IL-1β和TNF-α m RNA水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠滑膜组织中IL-17 m RNA、IL-1β m RNA及TNF-α m RNA表达均升高（P<0.05）；与模型组比较，膏药组和扶他林组IL-17 m RNA、IL-1β m RNA及TNF-α m RNA表达均明显降低（P<0.05），见Tab.2。

2.3祖师麻膏药对CIA小鼠踝关节组织中OPG、RANKL蛋白的影响

免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组小鼠踝关节组织中OPG蛋白表达降低，RANKL蛋白表达升高（P<0.01），与模型组比较，膏药组和扶他林组OPG蛋白表达升高，RANKL蛋白表达降低（P<0.05），见Fig.2-3。

2.4祖师麻膏药对CIA小鼠后爪Micro-CT变化的影响

Micro-CT三维成像结果显示，正常组小鼠关节骨质正常，未见骨质侵蚀及关节骨破坏；模型组小鼠后爪骨侵蚀严重，骨面破坏，骨量减少；干预结束后，与模型组比较，膏药组和扶他林组均能明显缓解小鼠后爪关节骨破坏，改善骨皮质密度，膏药组效果优于扶他林组，见Fig.4。

2.5祖师麻膏药对CIA小鼠踝关节滑膜组织病理学的影响

HE结果显示，正常组小鼠踝关节滑膜细胞平整，无炎性细胞渗出；模型组可见中度的炎性细胞浸润，滑膜细胞肿大，大量的血管翳形成及滑膜增生；干预结束后，与模型组比较，膏药组及扶他林组滑膜细胞肿大明显改善，有轻度的炎性细胞浸润，滑膜增生不明显，见Fig.5。

2.6祖师麻膏药对CIA小鼠踝关节组织破骨细胞变化的影响

TRAP染色结果提示：正常组小鼠踝关节有少量破骨细胞浸润；与正常组比较，模型组有大量破骨细胞浸润（P<0.01）；干预结束后，与模型组比较，膏药组及扶他林组破骨细胞数量明显减少（P<0.05），见Fig.6。

3、讨论

RA是一种以炎症和进行性骨破坏为特征的自身免疫性疾病，最终导致关节破坏和畸形。RA属于中医学“痹证”范畴，《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也”。《黄帝内经·素问·直解》记载：“痹，闭也，血气凝涩不行也”。《济生方·痹》曰：“皆因体虚，腠理空虚，受风寒湿气而成痹也”，指出风、寒、湿是重要病理因素，正气亏虚是发病之本。风寒湿痹日久不愈，气血运行不畅为瘀，瘀血痹阻经络，可见关节肿大，关节屈伸不利，导致关节骨破坏。外邪侵袭肢体，经络闭阻，不通则痛为主要病机，益气养血、培补肝肾、化瘀通络为基本治则。祖师麻具有祛风除湿，活血止痛之功效，在改善RA患者症状、抗炎、镇痛、缓解关节屈伸不利等方面疗效突出[11,15-16]。

滑膜炎性反应及骨破坏是RA的关键病理环节，增生性滑膜炎是RA软骨损伤和骨破坏的主要原因[17]。破骨细胞在骨破坏中起关键作用，在RA病理条件下，骨形成优于骨吸收，导致破骨细胞形成不协调[18]。RA活动期，在滑膜细胞增殖的部位形成血管翳，血管翳中有大量免疫细胞浸润，产生炎性细胞因子，如TNF-α和IL-17，血管增生，破骨细胞数量增加[5]。骨形成和骨吸收之间的平衡通过细胞因子网络的严格调节来维持，细胞因子控制骨骼系统和免疫系统之间的通信。虽然细胞因子的生理水平在维持骨完整性中是重要的，但是细胞因子的失调和病理生理水平在骨疾病的发展中是关键的参与者。

研究[19]表明RA患者关节液中含有大量的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-17，它们均能促进破骨细胞分化和活化，导致骨破坏。TNF-α是一种强有力的骨吸收诱导因子，在骨代谢和炎症性骨病中起重要作用[20]。TNF-α通过激活NF-κB信号通路直接诱导破骨细胞前体形成破骨细胞，亦通过诱导基质细胞、成骨细胞和活化T细胞表达巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和RANKL间接影响破骨细胞的生成，可以直接和间接的促进破骨细胞的分化[19]。IL-1β是强烈的破骨细胞生成性细胞因子，通过增强基质细胞中RANKL的表达，直接或间接刺激破骨细胞的分化[21]。T辅助细胞17(Th17细胞）是T细胞的一个特殊亚型，被认为在自身免疫性炎症和骨破坏中起关键作用[22]。初始T细胞通过IL-1β、白介素-6(IL-6）、白介素-21(IL-21）和转化生长因子-β(TGF-β）分化为Th17细胞，Th17细胞产生IL-17,IL-17介导先天免疫系统细胞中促炎细胞因子的表达产生促进局部破骨细胞分化的微环境，并通过诱导滑膜成纤维细胞中的RANKL受体激活剂激活破骨细胞，促进骨破坏[23]。研究[24-25]证实通过改善RA相关炎症因子及信号通路的表达，进一步减轻关节破坏，说明抗炎是改善RA骨破坏的关键因素。

OPG/RANKL信号通路在调节破骨细胞成熟和分化中起着重要作用，影响骨代谢的过程[26]。RANKL（肿瘤坏死因子配体超家族成员11,TNFSF11OPG）和OPG（肿瘤坏死因子受体超家族成员11B,TNFRSF11B）之间的平衡决定了破骨细胞的增殖程度和活性，其中生长因子和细胞因子对RANKL和OPG有不同的影响[27]。RANKL主要来源于基质细胞、骨细胞、软骨细胞，参与破骨细胞的分化，易打破骨平衡状态，使骨吸收优于骨形成，进而导致骨破坏[28]。OPG主要来源于B淋巴细胞和树突状细胞，是破骨细胞生成的负调节剂，通过与RANKL结合并阻碍RANKL-RANK相互作用，介导破骨细胞的过度分化、形成。研究[29]证实RA患者外周血中OPG表达和OPG/RANKL比值明显升高，OPG表达降低，且炎性因子可以促进RANKL分泌，抑制OPG分泌，进一步证实了炎性因子可以加速RA软骨和关节破坏。

本研究结果显示，模型组小鼠关节症状加重，滑膜中度炎性浸润，滑膜组织中IL-17、IL-1β和TNF-α m RNA水平表达升高，踝关节组织中OPG蛋白表达量降低，RANKL蛋白表达量升高，软骨组织中破骨细胞数量增加，CIA小鼠后爪骨侵蚀严重，骨面破坏，骨量减少，提示CIA小鼠足趾局部发生病变，炎性反应增强，骨破坏严重。祖师麻膏药干预后CIA小鼠关节炎症状减轻，滑膜轻度炎性浸润，滑膜组织中IL-17、IL-1β和TNF-αm RNA水平表达减低，踝关节组织OPG蛋白表达增加，RANKL蛋白表达降低，软骨组织中破骨细胞数量减少，改善骨皮质密度，缓解关节骨破坏。

扶他林[30]被证明对于骨关节炎及类风湿关节炎具有良好的抗炎作用，临床疗效明确，且透皮率较高，本研究使用它作为阳性对照组。本研究显示，扶他林可以改善CIA小鼠症状，降低IL-17、IL-1β和TNF-α m RNA水平表达，缓解炎性反应，改善骨破坏，但祖师麻膏药改善骨破坏作用优于扶他林。因此，本研究认为，祖师麻膏药明显改善RA骨破坏可能与抑制炎症反应有关。

综上所述，祖师麻膏药可通过降低炎症因子表达减轻RA炎症反应，缓解RA局部症状，亦可能通过调控OPG/RANKL信号轴抑制破骨细胞的分化及活化，增加骨量，改善骨密度，从而缓解关节骨及软骨破坏，最终发挥治疗RA的生物学效应。

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基金资助:甘肃省名中医王海东传承工作室(国中医药规财函[2021]242号); 国家自然科学基金项目(82260880); 甘肃省中医药项目(GZKP-2021-12); 祖师麻膏药的作用机制与临床疗效研究(2022-0915);

文章来源:杨娟娟,李浩林,杨天宁,等.祖师麻膏药对胶原诱导型关节炎小鼠炎症及骨破坏的抑制作用[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(09):979-987.