随着经济的发展，禽类养殖规模化水平进一步提升，禽类呼吸道疾病不断出现，对禽类的健康和生命有着严重威胁，同时也给养殖者带来巨大经济损失[1,2],禽类呼吸道疾病一般由金黄色葡萄球菌等致病菌引起，经空气、飞沫和密切接触传播，如何净化空气、切断空气传播是预防和控制此类疾病的重要方法。中医药在这方面积累了丰富的理论知识和实践经验，常将中药制造成香囊或直接烟熏等方式，使中药材里面的挥发性成分散发到空气中，在禽类周围形成保护层或激发禽类免疫蛋白分泌来提高免疫力，达到芳香避秽、调养正气和预防疾病的作用[3,4,5]。但这类产品使用相对麻烦，携带不便，因此，研制一款针对禽类呼吸道疾病预防的方便、安全、有效的中药固体空气清新剂具有巨大的发展前景和潜在的应用价值[6,7]。

国医大师周仲瑛针对新型冠状病毒肺炎疫情开出了包含艾叶、苍术、草果、广藿香、石菖蒲和白芷等中药材配方的防疫香囊，该方发挥作用的主要活性成分为挥发油。以此为基础，本试验旨在研制一款预防禽类呼吸道疾病的中药固体空气清新剂。香囊配方中的艾叶为菊科多年生草本植物，其挥发油能抑制和阻断多种细菌和病毒传播，具有驱邪净化和灭活病毒的作用，在我国传统医疗中常作为一味重要的中药来防治瘟疫[8,9];苍术为菊科植物，其挥发油具有芳香气味，可灭杀细菌和病毒，常用于流感病毒的防治[10,11];草果为姜科豆蔻属多年生草本植物，具有抑菌、抗氧化、破瘴截疟功效，其特有辛香味，在生活中常被用做调味料，是一味重要的药食同源中药[12,13];广藿香为唇形科刺蕊草属植物，其挥发油具有抗细菌、抗病毒、抗炎、杀虫和芳香化浊等作用，在一定程度上可预防禽流感和其他传染性疾病的发生[14,15];石菖蒲为天南星科植物，其挥发油具有醒神益智等广泛药理作用[16,17];白芷为伞形科植物，其挥发油具有抑制黑色素、抗氧化、镇痛和抗过敏等药理作用，是药品和调味品重要的活性成分，在医药、护肤品和香料等领域有广泛应用[18,19]。

本试验应用现代中药提取技术，采用超声辅助水蒸气蒸馏法[20,21]提取配方中药材的挥发油，将其制备成中药固体空气清新剂，进一步分析了该固体空气清新剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌3种呼吸道常见致病菌的抑菌效果，结果显示，所制备的中药固体空气清新剂保留了中药挥发油的主要成分和功效，具有较好的净化空气和抑菌效果，为后续开发清新、抑菌和预防禽类呼吸道疾病传播等多功效的中药空气清新剂提供了参考。

1、材料与方法

1.1主要试剂

白芷、石菖蒲、艾叶、苍术、广藿香和草果，均购自兵兵宏康中药饮片有限公司，符合《中华人民共和国药典》(2020版)的相关要求；卡拉胶、聚山梨醇酯和苯甲酸，均购自阿拉丁有限公司；蛋白胨、酵母粉和营养肉汤，均购自英国OXOID公司；氯化钠(NaCl)和琼脂粉，均购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.2主要仪器

J/10002电子天平(上海衡平仪器仪表厂),PTHW电热套(巩义市予华仪器有限责任公司),ZNHW3000ML电热套(上海凌科实业发展有限公司),CLF-04密封式粉碎机(浙江省温岭市创力药材器械厂),恒温培养箱、水浴恒温振荡摇床(常州市国旺仪器制造有限公司),HCB-1300V垂直层流洁净工作台(青岛海尔生物医疗股份有限公司)。

1.3菌株来源

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌，均由湖北医药学院微生物实验室提供。

1.4试验方法

1.4.1挥发油的提取

将白芷、石菖蒲、艾叶、苍术、广藿香和草果6种药材同比例均匀混合，再进行粉碎处理，称取粉碎好的混合药材、白芷、石菖蒲、艾叶、苍术、广藿香和草果各100 g,分别置于2 000 mL圆底烧瓶内，加入10倍量去离子水，超声20 min,振摇混合后静置40 min使药材浸泡充分，再连接挥发油测定器和回流冷凝管装置，置于控温电热套中缓缓加热至沸腾状态，沸腾后控制电热套加热温度，保持微沸状态加热6 h后停止，收集挥发油，放置4℃冰箱中保存备用[22,23,24]。

1.4.2固体空气清新剂的制备

以固体空气清新剂外观性状、气味和稳定性为指标，确定其处方和各组分的配比，具体设计如表1所示。

将卡拉胶或琼脂粉和苯甲酸加入40 mL蒸馏水中，在85～100℃条件下搅拌均匀，直至完全溶解，然后降温至50～60℃,保温搅拌，得第1种溶液；将1.4.1所制备的挥发油2 mL和聚山梨醇酯0.5 mL,分别加入7 mL蒸馏水中，搅拌均匀，得第2种溶液；将2种溶液混合，搅拌均匀，室温冷却即可得到固体空气清新剂[25]。

表1固体空气清新剂制备方案

1.4.3固体空气清新剂挥发性测试

同比例制备25、50和100 g 3种固体空气清新剂，将制备的含不同挥发油的固体空气清新剂置于室温20～25℃环境中让其自由挥发，每天进行测重，根据公式(1)计算当天的挥发量。

挥发量=前1天测重-当天测重(1)

1.4.4固体空气清新剂抑菌性和稳定性测试

挑取生长在固体培养基上的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的单克隆菌落，分别接种至LB液体培养基中生长，于37℃、180 r/min摇床中培养16～24 h,制备细菌悬液备用[26,27]。

取制备好的固体空气清新剂，让其在室温环境下挥发，取挥发程度分别为0%、10%、20%、50%、80%和90%的固体空气清新剂，切割成直径5 mm的小圆块，平放于无菌培养皿里，室温下置于超净工作台中紫外照射30 min后备用。

分别吸取20μL 3种细菌悬液至固体培养基表面，涂沫均匀，盖好培养皿，置于超净工作台中干燥5 min。用无菌镊子将切割的含不同挥发油的固体空气清新剂小圆块分别贴放于每个培养皿表面中心，置37℃恒温箱培养16 h,观察菌落生长情况，用十字交叉法测量抑菌圈直径大小。根据抑菌圈直径大小比较含不同挥发油的固体空气清新剂的抑菌性，评价标准见表2。

表2抑菌圈法抑菌性评价标准

2、结果

2.1挥发油的提取

通过超声辅助水蒸气蒸馏法提取挥发油，结果如图1所示，每100 g原料中，混合药材可提取挥发油0.7 mL、艾叶可提取挥发油0.8 mL、苍术可提取挥发油0.5 mL、草果可提取挥发油0.4 mL、广藿香可提取挥发油0.5 mL、石菖蒲可提取挥发油0.4 mL、白芷暂未提取到挥发油，即在相同条件下，艾叶提取挥发油的量最多，苍术和广藿香提取挥发油的量次之，草果和石菖蒲提取挥发油的量最少，白芷由于工艺原因未能提取出挥发油。根据单独中药挥发油的提取量和颜色，可以看出混合药材的挥发油是以艾叶挥发油为主，同时含有其他挥发油的化学成分。

图1中药提取的挥发油 

2.2固体空气清新剂的制备

根据表1的方案制备固体空气清新剂，结果显示，以琼脂粉作为增溶剂制备的空气清新剂内部为浑浊状态，凝固后表面没有用卡拉胶制备的光滑，且存放后有水分从表面渗透出来，表明其稳定性不如卡拉胶制备的固体空气清新剂；且琼脂粉的价格比卡拉胶贵，因此选择卡拉胶作为增溶剂。以卡拉胶制备的3个固体空气清新剂样品中，样品1未能完全凝固，不能成型；样品3和5均能成型，但样品5的硬度过高，不利于挥发油后续的挥发，因此选择样品3的方法来进行固体空气清新剂的制备，即由卡拉胶(20%)、苯甲酸(0.2%)、挥发油(4%)、聚山梨醇脂(1%)和蒸馏水(余量)组成。

根据选择的方法，分别制备了未添加挥发油的空白样品(A0)、添加混合挥发油的样品(A1)和分别添加艾叶、苍术、草果、广藿香和石菖蒲单一药材挥发油的样品(A2～A6),如图2所示，制得的中药固体空气清新剂样品均外观良好，表面平整光滑，内部清澈无气泡，整体硬度适中，韧性好，凝固前为流动性好的液体，便于后续分装和模具成型。

图2制备的固体空气清新剂样品(A0～A6)   

2.3固体空气清新剂的挥发性测试

将同比例制备的不同重量的固体空气清新剂于室温放置，结果显示，25 g固体空气清新剂在12 d左右挥发完毕，持续效果短，更换频繁；100 g固体空气清新剂在30 d以后，挥发量显著变少，挥发时间较长，后期不利于净化空气和抑制细菌扩散；50 g固体空气清新剂在25 d基本挥发完毕，挥发时间适中，能够满足人们日常生活对空气清新和抑菌的双重需求，因此选择50 g固体空气清新剂制备成最终成品。对50 g固体空气清新剂在室温下进行自由挥发测试，记录其每天减少的重量(挥发量),结果如表3所示，含不同挥发油的固体空气清新剂挥发量较均匀，平均每天以2 g的量进行挥发，挥发过程中无水渗透，没有发生霉变和裂开等现象。

表3含不同挥发油的固体空气清新剂的挥发量

2.4固体空气清新剂的抑菌性和稳定性测试

使用制备好的6个添加不同挥发油的固体空气清新剂(A1～A6)和1个空白样品(A0)分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌3种致病菌进行抑菌试验，结果如图3～5所示，与空白样品(A0)相比，添加挥发油的固体空气清新剂(A1～A6)对大肠杆菌无明显的抑制效果，表明添加的挥发油虽然有抑菌性，但制成固体空气清新剂后，其效果可能发生了改变，对大肠杆菌没有明显的抑制效果(图3);与空白样品(A0)相比，除了A4外，其他5个添加挥发油的固体空气清新剂样品对金黄色葡萄球菌的生长都有一定抑制效果，但抑制效果有一定差异，其中A1、A2、A6和A5的抑菌效果较好，A3效果不明显(图4);空白样品(A0)相比，除了A4、A5、A6外，A1、A2和A3对白色葡萄球菌有明显的抑菌效果，且抑菌效果差异不显著(图5)。

图3含不同挥发油的固体空气清新剂(A0～A6)对大肠杆菌的抑菌效果  

图4含不同挥发油的固体空气清新剂(A0～A6)对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 

图5含不同挥发油的固体空气清新剂(A0～A6)对白色葡萄球菌的抑菌效果 

为了进一步对其抑菌性能进行比较，对抑菌圈直径大小进行了测量，结果如表4所示，对金黄色葡萄球菌，抑菌圈直径由大到小为A1>A6>A5>A2>A3,即混合药材固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为20.1 mm,属于高敏；对白色葡萄球菌，抑菌圈直径由大到小为A1>A2>A3,即混合药材固体空气清新剂对白色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为41.7 mm,属于高敏。说明在相同条件下，几种挥发油混合后发生协同作用，使混合药材固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的抑菌效果较单独中药的更好，并且其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径小于对白色葡萄球菌的抑菌圈直径，表面所制备的固体空气清新剂对白色葡萄球菌的抑制作用强于金黄色葡萄球菌。

进一步验证不同挥发程度的混合药材固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的抑菌效果，分别使用未挥发(0%)以及挥发了10%、20%、50%、80%和90%的固体空气清新剂对这2种致病菌进行抑菌试验，结果如图6和图7显示，随着挥发时间和程度的逐渐增加，固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的抑菌效果有所减弱，挥发了90%的固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为6.81和7.32 mm,即仍具有一定的抑菌效果。

表4含不同挥发油的固体空气清新剂对供试菌的抑菌圈直径测量

图6不同挥发程度的混合药材固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 

图7不同挥发程度的混合药材固体空气清新剂对白色葡萄球菌的抑菌效果

3、讨论

现代社会禽类养殖产业规模巨大，但空气污染、病微生物入侵导致的禽类呼吸道疾病频发，整体情况不容乐观，人们对于如何净化空气、减少细菌和病毒传播、预防禽类呼吸道疾病越来越关注，要求越来越高。目前，市场所售空气清新剂大多含有有毒有害化学成分，对禽类健康可能造成伤害[28],因此，本试验采用国医大师周仲瑛的防疫香囊配方，通过改变剂型，将中药香囊制成更方便使用的固体空气清新剂，以纯天然混合中药的挥发油为主要活性成分，制备了品质和外观俱佳、安全无害的中药固体空气清新剂。通过琼脂扩散法对比了混合药材固体空气清新剂和单独药材固体空气清新剂的抑菌性，结果显示，单独药材固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌有一定抑菌效果，混合药材固体空气清新剂对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的抑菌效果较单独药材固体空气清新剂更好，抑菌圈直径更大，分别为20.1和41.7 mm,属于高敏。结果表明，配方中多种中药挥发油混合具有协同增效作用，其抑菌效果得到增强，对常见的呼吸道致病菌有一定的抑制作用，即混合药材固体空气清新剂通过抑制致病菌的增长和繁殖，达到预防呼吸道疾病传播的目的，且其对白色葡萄球菌的抑制作用较强。为了进一步考察该固体空气清新剂的稳定，使用不同挥发程度的混合药材固体空气清新剂进行抑菌试验，结果显示，挥发了90%的固体空气清新剂仍对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌有一定抑制效果。结果表明，所制备的中药固体空气清新剂具有较好的稳定性。另外，在感官上，通过嗅觉感知到中药固体空气清新剂的气味和感受清新，本试验为后续开发纯天然、安全、无毒、具有抑菌和预防禽类呼吸道疾病传播的中药固体空气清新剂提供了参考。

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基金资助:十堰市科技局一般项目(19K68);湖北省中央引导地方专项基金(2019ZYYD071);湖北医药学院校级人才启动金(K12873);

文章来源:唐豫媛,周晓彤,包凤珠,等.预防禽类呼吸道疾病的中药固体空气清新剂研制和抑菌效果分析[J].中国兽医杂志,2024,60(05):125-131.